蛋白质分离纯化(I)

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1、2.6蛋白质的分离、纯化研究蛋白质的结构、性质和功能，首先需要得到纯的蛋白质样品。(1)蛋白质来源：微生物细胞、动物细胞和植物细胞；(2)随时测定蛋白质活性并检测蛋白质含量。(3)分离和纯化过程都必须在温和的条件下进行。一、蛋白质分离纯化的一般原则(1)生物组织的机械破碎。常用的方法有研磨法、超声波法、冻融法和酶解法等。(2)根据蛋白质的特性，选择不同的溶剂进行抽提。水溶性蛋白用中性缓冲溶液抽提，酸性蛋白用稀碱性溶液抽提，脂溶性蛋白用表面活性剂抽提等。(3)粗提:离心除去固体杂质后，可通过沉淀法、超滤法、萃取法等处理，得到蛋白质粗制品。(4)精制：可用层析法、电泳法等进行精

2、制。(5)成品加工：测定蛋白质的性质并干燥成成品。蛋白质的分离步骤四、蛋白质的纯化方法根据蛋白质的亲水胶体性质，当其环境发生改变时，蛋白质会发生沉淀作用(Precipitation)。因为蛋白质分子量大小不同、表面所代电荷不同、表面的亲水和疏水区域不同，所以可以通过可逆沉淀法将蛋白质分离出来。沉淀法具有部分纯化、浓缩特点。(1)沉淀法蛋白质的纯化方法蛋白质的纯化方法蛋白质在高浓度的中性盐溶液中，由于水化层被破坏和表面电荷被中和，容易发生沉淀阴离子化合物的效果是：NH4+>K+>Na+阳离子化合物的效果是：PO43->SO42->Cl-常用的盐为硫酸铵。不同的蛋白质由于所带的

3、电荷和水化程度不同，盐析时所需的盐的浓度也不相同，因而可以将不同的蛋白质加以分离。(1)沉淀法盐析蛋白质的纯化方法在蛋白质溶液中，加入一定量的与水互溶的有机溶剂，由于这些溶剂与水的亲和力强，能够破坏蛋白质的水化层，使蛋白质的溶解度降低而沉淀。常用的有机溶剂有乙醇、甲醇和丙酮等。为了防止蛋白质在分离过程中发生变性，有机溶剂浓度不能太高(30%-50%)，而且需要在低温条件下进行。－5℃，25％乙醇沉淀卵清蛋白。(1)沉淀法有机溶剂沉淀法蛋白质的纯化方法蛋白质分子在等电点时，净电荷为零，分子之间的静电排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀。当蛋白质混合物溶液的pH被调到某一成分的

4、等电点时，则该蛋白质大部或全部将沉淀出来。而那些等电点高于或低于该pH的蛋白质仍然留在溶液中。该法适用于在等电点pH稳定的蛋白质。(1)沉淀法等电点沉淀法蛋白质的纯化方法Dialysis此法是利用蛋白质分子不能透过半透膜，而使它与其它小分子化合物，如无机盐、单糖、双糖、氨基酸、小肽以及表面活性剂等分离。常用的半透膜有玻璃纸或高分子合成材料，截止分子量一般为一万。（2）膜分离法透析法蛋白质的纯化方法透析是将待纯化的蛋白质溶液装在用半透膜制成的透析袋内，再将透析袋放入透析液（通常是蒸馏水或缓冲液）中进行透析。通透动力为半透膜两侧的物质浓度差。（2）膜分离法透析法蛋白质的纯

5、化方法超过滤技术是在一定的密封容器，施加一定压力使一定分子量的物质透过超滤膜。其中包括有：中空纤维超滤器、圆筒式超滤器板式超滤器。（2）膜分离法超过滤法蛋白质的纯化方法离子交换层析法（3）层析法蛋白质的纯化方法此法又称为分子筛层析（gel-filtrationchromatography）。凝胶过滤所用的介质是由交联葡萄糖、琼脂糖或聚丙烯酰胺形成的凝胶珠。凝胶珠的内部是多孔的网状结构。Sephadex-葡聚糖凝胶G10-G200Sepharose-琼脂糖凝胶2B,4B,6BSephacryl-丙烯酰胺葡聚糖凝胶S100,S200,S300,S400凝胶过滤法（3）层析

6、法分子筛层析（gel-filtrationchromatography）原理基质葡聚糖凝胶（sephadex）琼脂糖凝胶（sepharose）应用测定分子量:lgMr=a-bVe脱盐和浓缩分离提纯生物大分子这是一种高效分离纯化蛋白的方法。其原理是不同的蛋白质分子对于固定化在载体上的特殊配基具有不同的识别和结合能力。选择与待纯化蛋白质具有特殊识别和结合作用的配基，然后应用化学方法将该配基与载体共价连接。将这种连接有配基的载体装入层析柱中。当含有待纯化的蛋白质溶液通过层析柱时，该蛋白质即与配基发生特异性结合而被吸附在层析柱上，而其它蛋白质则流出柱外。被特异性结合在层析柱上的蛋白

7、质，可以用适当的配体洗脱液洗脱。③亲和层析法（3）层析法亲和层析（affinitychromatography）应用分离纯化酶、抗原、抗体分离纯化核酸研究酶的结构与功能+待纯化分子配体a.待纯化分子和配体间具有亲和性+基质b.活性基质与配体结合产生亲和吸附剂++杂质c.待纯化分子与亲和吸附剂结合，与杂质分离+d.偶联复合物经解离后，得到纯的待纯化分子原理：基质纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、sepharose、sephadex蛋白质的纯化方法在外电场的作用下，带电颗粒将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。蛋白质溶