蛋白质的化学修饰(I)

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1、蛋白质的化学修饰主要内容化学修饰的原理蛋白质侧链的修饰蛋白质肽链的交联蛋白质的位点专一性修饰化学修饰结果的解释蛋白质化学修饰的应用蛋白质化学修饰的局限性一、化学修饰的原理概念：从广义上说，凡是通过化学基团的引入或除去，而使蛋白质共价结构发生改变，都可称为蛋白质的化学修饰。有的情况下化学结构的改变并不影响蛋白质的生物学活性(称非必需部分的修饰);但大多情况下将导致生物活性的改变(如下降以至完全丧失)。影响蛋白质化学修饰反应进程的因素：1.蛋白质功能基的反应性；2.修饰剂的反应性。1.1蛋白质功能基反应性的影响因素蛋白质的功能基所处的环境强烈地影响其理化性质，其分子的表面特征也影响化学试剂的接近

2、。功能基的反应性是通过其亲核性来测量的，而亲核性又常常与其酸碱性(即pK值)有关。1.1.1微区的极性决定基团解离状态的关键因素之一。从整体来看，局部极性的改变对氨基酸反应性影响：Tyr、Cys、-COOH>-NH2、His>Trp、Met和胱氨酸。1.1.2氢键效应天然蛋白质或其离子通过氢键维持其稳定性，也是使pK值发生改变的一个因素。如水杨酸的-COOH可与酚基形成O-H…O氢键，结果使其-COOH的pK值比正常值小1个pH单位，同时使酚基的正常pK10改变到pK13。因此在蛋白质的酚基-羧基相互作用中，羧基的pK值应比正常值低，而酚基的pK值高于正常值。1.1.3静电效应由于带电基团相

3、互影响，导致同种氨基酸残基在不同的蛋白质中pK值存在差异。如用高分辨率的NMR对His的电离行为研究表明：碳酸酐酶和葡萄球菌核酸酶各有4个His残基，其pK值是：碳酸酐酶：5.91；6.04；7.00；7.23葡萄球菌核酸酶：5.37；5.71；5.74；6.50His残基在这两个蛋白质中pK值几乎相差2个pH单位。1.1.4空间障碍(位阻效应)处于蛋白质表面的功能基,一般来说比较容易与修饰剂反应,但如果烷基在空间上靠近功能基团,会使修饰剂不能与功能基团接触,出现位阻效应。此外，其它因素也能改变蛋白质功能基反应性，如电荷转移、共价键形成、金属螯合、旋转自由度等。1.2蛋白质功能基的超反应性超

4、反应性：指蛋白质的某个侧链基团与个别试剂能发生非常迅速的反应。酶的催化活性基团通常对修饰剂是有反应的，但酶的超反应基团不一定是酶活性部位上的基团，可能与酶的功能或构象没有明显联系。1.2蛋白质功能基的超反应性影响因素：1.改变蛋白质功能基的pKa值；2.蛋白质功能基具有较大的亲核性；3.通过静电相互作用吸引试剂，并使其有适当的取向；4.试剂与靠近修饰部位的蛋白质区域之间的立体化学适应性；5.试剂的结合。1.3修饰剂反应性的决定因素1.选择性吸附：化学修饰前，修饰剂根据各自的特点，选择性地吸附于低或高极性区的，有时可以根据对速度的饱和效应，检测出蛋白质-修饰剂复合物的形成，类似酶-底物复合物。

5、2.静电相互作用：带电的修饰剂能选择性地吸引到蛋白质表面带相反电荷的部位。该作用可使修饰剂向多功能部位中的一个残基定位，或向双功能基一侧定位。此外，静电排斥力能抑制修饰作用。1.3修饰剂反应性的决定因素3.位阻因素：蛋白质表面的位阻因素，或底物、辅因子、抑制剂所产生的位阻因素都能阻止修饰剂与功能基的正常反应。但修饰的结果却能提供蛋白质表面的有用信息。4.催化因素：修饰部位附近的其它功能基，若起一般的酸碱催化作用，也能影响修饰反应。5.局部环境的极性：许多有机反应的速度与溶剂的极性有关，而有些反应则与极性无关；疏水环境能阻止产物中电荷分离的反应。主要内容化学修饰的原理蛋白质侧链的修饰蛋白质肽链

6、的交联蛋白质的位点专一性修饰化学修饰结果的解释蛋白质化学修饰的应用蛋白质化学修饰的局限性二、蛋白质侧链的修饰蛋白质侧链的修饰主要是通过选择性的试剂或亲和标记试剂与蛋白质侧链上特定的功能基团发生化学反应而实现的。其重要作用是用于探测活性部位的结构。理想情况下,修饰试剂只是选择性地与某一特定的残基反应,很少或几乎不引起蛋白质分子构象变化。在20种常见AA残基中，仅具极性的侧链基团才能够进行化学修饰，这些基团的反应性取决于其亲核性。2.1特定的AA残基侧链基团的反应试剂2.1.1酰化及其相关反应这类化学修饰试剂如乙酰咪唑、二异丙基磷酰氟(DFP)、酸酐磺酰氯、硫代三氟乙酸乙酯和O-甲基异脲等，在

7、室温(20ºC~25ºC)，pH4.5~9.0的条件下可与蛋白质某些侧链基团如-NH2、-OH、-SH及酚基等发生酰基化反应。2.1.2烷基化反应此类试剂(如DNFB、碘代乙酸、碘代乙酰胺、苯甲酰卤代物、碘甲烷等)常带有活泼的卤素原子，因其电负性而使烷基带部分正电荷，易于导致蛋白质分子的亲核基团(如-NH2、-SH、-COOH、-SCH3和咪唑基)发生烷基化。2.1.3氧化和还原反应H2O2、N-溴代琥珀酰亚