实验报告2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法

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1、实验二SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE）测定蛋白质的分子量1原理1.1聚丙烯酰胺凝胶的性能及制备原理1.1.1性能聚丙烯酰胺凝胶的机械性能好，有弹性，透明，相对地化学稳定，对pH和温度变化比较稳定，在很多溶剂中不溶，是非离子型的，没有吸附和电渗作用。通过改变浓度和交联度，可以控制孔径在广泛的范围内变动，并且制备凝胶的重复性好。由于纯度高和不溶性，因此还适于少量样品的制备，不致污染样品。1.1.2制备原理聚丙烯酰胺凝胶是用丙烯酰胺（Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下聚合而成。聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化系

2、统有化学聚合和光聚合两种。本实验是用化学聚合。化学聚合的催化剂通常多采用过硫酸铵（AP）或过硫酸钾，此外还需要一种脂肪族叔胺作加速剂，最有效的加速剂是N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）。在叔胺的催化下，由过硫酸铵形成氧的自由基，后者又使单体形成自由基，从而引发聚合反应。叔胺要处于自由碱基状态下才有效，所以在低pH时，常会延长聚合时间；分子氧阻止链的延长，妨碍聚合作用；一些金属也能抑制聚合；冷却可以使聚合速度变慢。通常控制这些因素使聚合在1小时内完成，以便使凝胶的性质稳定。1.1.3凝胶浓度和交联度与孔径的关系凝胶浓度根据被

3、分离的物质的分子量大小确定。当分析一个未知样品时，常先用7.5%的标准凝胶或用4~10%的凝胶梯度来试测，而后选出适宜的凝胶浓度。凝胶的机械性能、弹性是否适中很重要，胶太软易断裂，；太硬则脆，也易折断。1.2SDS-凝胶电泳法测定蛋白质分子量的原理蛋白质分子在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于所带净电荷及分子的大小和形状等因素。如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入SDS和巯基乙醇，则蛋白质分子的迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。在蛋白质溶液中加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原；SDS能使蛋白

4、质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS复合物。SDS与蛋白质的结合带来两个后果：第一，使各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别，使所有的SDS-8蛋白质复合物在电泳时都以同样的电荷／蛋白质比向正极移动；第二，SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。这两个原因使蛋白质-SDS复合物在凝胶电泳中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是蛋白质分子量的函数。选择一系列不同分子量的球形或基本呈球形的蛋白质作为标准物，使其形成SDS复合物。把这些复合物在相同条

5、件下进行电泳分离，分子量小的物质泳动距离大，分子量大的物质泳动距离小。测定出相对泳动率，用相对泳动率对蛋白质的分子量的对数作图，它们在一定范围内呈直线关系。因此可作为标准曲线来检测样品蛋白质的分子量。1.3染色原理常用的染料主要有氨基黑10B、考马斯亮蓝R250、考马斯亮蓝G250、1-苯胺基-8-萘磺酸，各有优缺点，本实验选用考马斯亮蓝R250，它的染色灵敏度比氨基黑高5倍，尤其适用于SDS电泳微量蛋白质染色。2试剂与器材2.1试剂2.1.1（1号液）凝胶贮备液丙烯酰胺（Acr）29.2g甲叉双丙烯酰胺（Bis）0.8g加蒸馏水至1

6、00mL2.1.2（2号液）浓缩胶缓冲液（0.5mol／LTris-HCl缓冲液，pH6.8）三羟甲基氨基甲烷（Tris）6g加蒸馏水约50mL，溶解后以6mol／LHCl调到pH6.8，定容至100mL2.1.3（3号液）分离胶缓冲液（1.5mol／LTris-HCl缓冲液，pH8.8）三羟甲基氨基甲烷（Tris）18.15g加蒸馏水约50mL溶解后以6mol／LHCl调到pH8.8加蒸馏水至100mL2.1.4（4号液）10%十二烷基硫酸钠（SDS）水溶液SDS*（电泳用）1.0g蒸馏水10.0mL2.1.5（5号液）过硫酸铵（A

7、PS）溶液8过硫酸铵100mg蒸馏水1.0mL临用前配置2.1.6（6号液）N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）2.1.6电泳缓冲液Tris3g甘氨酸14.4g4号液10ml加蒸馏水至1000mL2.1.5样品缓冲液2号液0.5mL4号液4mL甘油2mLβ-巯基乙醇1mL0.04%溴酚蓝0.5mL加水至10mL2.1.9染色剂考马斯亮蓝R2500.31g甲醇125mL乙酸25mL蒸馏水100mL2.1.10脱色剂甲醇250mL乙酸50mL蒸馏水200mL2.1.11保存液7%乙酸水溶液2.1.12SDS-PAGE低分子量标准

8、蛋白质蛋白质名称分子量（MW）兔磷酸化酶B97400牛血清白蛋白66200兔肌动蛋白430008牛碳酸酐酶31000胰蛋白酶抑制剂20100鸡蛋清溶菌酶144002.2器材电泳仪，垂直板电泳槽，酸度计，电导仪，分析天平，