2019实验报告2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法

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1、实验报告2SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法　　实验二SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量　　1原理　　聚丙烯酰胺凝胶的性能及制备原理性能　　聚丙烯酰胺凝胶的机械性能好，有弹性，透明，相对地化学稳定，对pH和温度变化比较稳定，在很多溶剂中不溶，是非离子型的，没有吸附和电渗作用。通过改变浓度和交联度，可以控制孔径在广泛的范围内变动，并且制备凝胶的重复性好。于纯度高和不溶性，因此还适于少量样品的制备，不致污染样品。制备原理　　聚丙烯酰胺凝胶是用丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化剂的作用下聚合而成。聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化系统有化学聚合和光聚合两种。本实

2、验是用化学聚合。化学聚合的催化剂通常多采用过硫酸铵或过硫酸钾，此外还需要一种脂肪族叔胺作加速剂，最有效的加速剂是N,N,N’,N’-四甲基乙二胺。在叔胺的催化下，过硫酸铵形成氧的自基，后者又使单体形成自基，从而引发聚合反应。叔胺要处于自碱基状态下才有效，所以在低pH时，常会延长聚合时间；分子氧阻止链的延长，妨碍聚合作用；一些金属也能抑制聚合；冷却可以使聚合速度变慢。通常控制这些因素使聚合在1小时内完成，以便使凝胶的性质稳定。　　凝胶浓度和交联度与孔径的关系　　凝胶浓度根据被分离的物质的分子量大小确定。当分析一个未知样品时，常先用%的标准凝胶或用4~10%

3、的凝胶梯度来试测，而后选出适宜的凝胶浓度。凝胶的机械性能、弹性是否适中很重要，胶太软易断裂，；太硬则脆，也易折断。SDS-凝胶电泳法测定蛋白质分子量的原理　　蛋白质分子在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于所带净电荷及分子的大小和形状等因素。如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入SDS和巯基乙醇，则蛋白质分子的迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。　　在蛋白质溶液中加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原；SDS能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS复合物。SDS与蛋白质的结合带来两个后果：第

4、一，使各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别，使所有的SDS-　　1　　蛋白质复合物在电泳时都以同样的电荷／蛋白质比向正极移动；第二，SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。这两个原因使蛋白质-SDS复合物在凝胶电泳中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是蛋白质分子量的函数。　　选择一系列不同分子量的球形或基本呈球形的蛋白质作为标准物，使其形成SDS复合物。把这些复合物在相同条件下进行电泳分离，分子量小的物质泳动距离大，分子量大的物质泳动距离小。测定出相对泳动率，用相对泳动率对蛋白质的分子

5、量的对数作图，它们在一定范围内呈直线关系。因此可作为标准曲线来检测样品蛋白质的分子量。染色原理　　常用的染料主要有氨基黑10B、考马斯亮蓝R250、考马斯亮蓝G250、1-苯胺基-8-萘磺酸，各有优缺点，本实验选用考马斯亮蓝R250，它的染色灵敏度比氨基黑高5倍，尤其适用于SDS电泳微量蛋白质染色。　　2试剂与器材　　试剂　　凝胶贮备液　　丙烯酰胺　　g甲叉双丙烯酰胺　　g加蒸馏水至　　100mL　　浓缩胶缓冲液　　三羟甲基氨基甲烷　　6g加蒸馏水约50mL，溶解后以6mol／LHCl调到pH，定容至100mL　　分离胶缓冲液　　三羟甲基氨基甲烷　　g加

6、蒸馏水　　约50mL溶解后以6mol／LHCl调到pH　　加蒸馏水至　　100mL10%十二烷基硫酸钠水溶液　　SDS*　　g蒸馏水　　mL过硫酸铵溶液　　2　　过硫酸铵　　100mg蒸馏水　　mL临用前配置　　N,N,N’,N’-四甲基乙二胺电泳缓冲液　　Tris　　3g甘氨酸　　g4号液　　10ml加蒸馏水至　　1000mL样品缓冲液　　2号液　　mL4号液　　4mL甘油　　2mLβ-巯基乙醇　　1mL%溴酚蓝　　mL加水至10mL染色剂　　考马斯亮蓝R250　　甲醇　　125mL乙酸　　25mL蒸馏水　　100mL脱色剂　　甲醇　　250mL乙酸　

7、　50mL蒸馏水　　200mL保存液　　7%乙酸水溶液　　SDS-PAGE低分子量标准蛋白质　　蛋白质名称　　分子量兔磷酸化酶B　　97400牛血清白蛋白　　66200兔肌动蛋白　　43000　　3　　牛碳酸酐酶　　31000胰蛋白酶抑制剂　　20XX0鸡蛋清溶菌酶　　14400器材　　电泳仪，垂直板电泳槽，酸度计，电导仪，分析天平，真空泵，高速台式离心机，微量加样器，染色槽，电炉。　　3实验步骤　　制备电泳分离胶　　根据样品分子量的大小，配制所需浓度的分离胶。10~100K分子量的样品，宜采用T=12%的胶，40~200K分子量的样品宜采用T=%的胶。

8、本实验采用T=10%的胶，具体配方如下：　　分离胶：　　　　1号液　　10mL3