外周血单核细胞的分离以及培养

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1、一、牛外周血单核细胞的分离1、采血袋采集200ml血液2、首先在15ml离心管加3ml分离液（室温）3、轻轻的将3ml全血加到3ml分离液中4、400g室温离心30min5、离心后，吸取白膜层（0.5cm）转移到新的离心管6、加10ml的PBS或是培养基，进行混匀（枪轻轻吹打）7、250g室温离心10min8、加5ml的PBS或是培养基，进行混匀（枪轻轻吹打）9、250g室温离心10min10、重复8、9，加0.5ml培养液悬浮，二、磁珠分选11、将分离得到的PBMCs进行细胞计数。12、离心细胞悬液，300×g，10分钟。吸去上清。13、将细胞沉淀用

2、buffer（含0.5％BSA的PBS）悬浮，按每107个细胞加80μLbuffer和20μL抗CD14磁珠，充分混匀，2-8℃孵育15分钟。14、300×g，10分钟。吸去上清。用500μLbuffer重悬细胞。15、将柱子放在磁珠分离器上，吸取细胞悬液加到柱子中，用500μLbuffer清洗三遍柱子。16、待清洗三遍后，将柱子从磁珠分选器上取下来，加入1mLbuffer，用助推器快速推动柱子中的洗脱buffer，收集单核细胞，计数。17、单核细胞300×g离心，10分钟，用含10％的胎牛血清、100U/mL青链霉素、PH7.2-7.4的1640（I

3、MDM）全培养液调整细胞浓度为按1×106单核细胞铺入10cm培养皿，37℃5%CO2温箱中培养。三、磁珠分选注意事项1、柱容量：1×107磁性标记细胞可上达2×108细胞总量。注意：当分选的细胞比淋巴细胞大时，柱容量需减少。2、建议白细胞样本大小：在106—2×108细胞总量中有104—107标记细胞3、典型富集率：50fold至1000fold,取决于磁性标记的活力和特性，达到10000fold富集量就可以分装两柱。4、柱流动停止，不要干涸5、Void容积:60ul.贮液器容积3.5ml6、PBS典型的流量包含0.5%BSA：0.35-0.5ml/

4、min。7、MS柱不可重复使用。MS柱的准备：1、准备用buffer漂洗的MS柱：取500uldegassdebuffer到柱的上部，并使buffer流过全柱。MS柱流动停止，不要干涸。2、弃掉废液更换收集管。此时的MS柱可用于磁珠分选。注意：装满之后快速使用，避免温度升高产生气泡。用buffer装满柱的时间取决于贮存环境，温度和湿度。因此，时间可能从几秒到变到几分钟。这个时间并不影响分选质量。用MS柱进行磁珠分选：在进行下一步之前要等到柱子的贮液器是空的。1、在500ul的degassedbuffer中重悬上达108的细胞总量。注意：细胞数目增加，按

5、比例增加buffer体积。当新鲜抗凝血剂的血液或白膜层一起作用时，分选之前用buffer稀释为1：2。除去团块使细胞通过预分选过滤器。2、将分选的细胞放至准备好的MS柱上，收集流动的未被标记的细胞。3、用3×500ul的degassedbuffer清洗MS柱。收集未标记的细胞使其与步骤2获得的结合。注意：执行清洗步骤，柱子储液器一旦空了就要添加buffer4、从分选器上取下MS柱，更换新的收集管5、吸取1mlbuffer至MS柱，快速驱赶片段伴有磁性标记细胞....（不懂）1、为增加磁性标记细胞的纯度，经过第二个MS柱洗提片段可以增加其纯度。用一个新的

6、柱子重复磁珠分选流程步骤2-5。2、3、4、