分子生物学绝对重点

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1、基因克隆的一般步骤：1.从生物有机体基因组屮，分离出带有日的基因的DNA片段。2.将带有目的基因的外源D7A片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DM分子。3.将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。4.从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞，并筛选出己经得到扩增的目的基因。5.将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使Z在新的遗传背景下实现功能表达，研究核酸序列与蛋白质功能之间的关系。原核基因调控机制的类型与特点可分为可诱导调节和可阻遏调节两大类：可诱导调节：一些基因在特殊

2、的代谢物或化合物的作用下，由原来关闭的状态变为工作状态，即在某些物质的诱导下使基因活化。（例：大肠杆菌的乳糖操纵子、分解代谢蛋白的基因）可阻遏调节：基因平时是开启的，在产生蛋白质或酶的工作过程屮，由于一些特殊代谢物或化合物的积累而将其关闭,阻遏了基因的表达。（例：色氨酸操纵子、合成代谢蛋白的基因）基因对调节蛋白（阻遏蛋白或激活蛋白）的应答，可分为：正转录调控、负转录调控在止转录调控系统屮，调节基因的产物是激活蛋白，根据激活蛋白的作用性质分为止控诱导系统和止控阻遏系统。在正控诱导系统中，效应物分子（诱导物）的存在使激活蛋白处于活性状态；在正控阻遏系统

3、中，效应物分子（辅阻遏蛋物）的存在使激活蛋白处于非活性状态。在负转录调控系统中，调节基因的产物是阻遏蛋白，起着阻止结构基因转录的作用。阻遏蛋白作用的部位是操纵区。根据其作用特征又可分为负控诱导和负控阻遏。在负控诱导系统屮，阻遏蛋白不与效应物（诱导物）结合时，结构基因不转录；在负控阻遏系统屮，阻遏蛋白与效应物（辅阻遏物）结合时，结构基因不转录。乳糖操纵子构成及机制组成：大肠杆菌乳糖操纵子含z、Y、A三个结构基因，分别编码半乳糖苜酶、透酶和半乳糖苜乙酰转移酶，此外还有一个操纵序列0,—个启动子P和一个调节基因I。乳糖操纵子同时受正性调节和负性调节。机制

4、：①阻遏蛋白的负性调节：没有诱导物存在时，I基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列0处，乳糖操纵子处于阻遏状态，不能合成分解乳糖的三种酶；有诱导物存在时，诱导物诱导阻遏蛋白变构，不能结合于操纵序列，乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酚。所以，乳糖操纵子的这种调控机制为可诱导的负调控。②CAP的正性调节：在启动子上游有CAP结合位点，当大肠杆菌从以葡萄糖为碳源的环境转变为以乳糖为碳源的环境时，cAMP浓度升高，与CAP结合，使CAP发生变构，CAP结合于乳糖操纵子启动序列附近的CAP结合位点，激活RNA聚合酶活性，促进结构基因转录，调节蛋白结合于操纵子

5、后促进结构基因的转录，对乳糖操纵子实行正调控，加速合成分解乳糖的三种酶。因此，乳糖操纵子屮的I基因编码的阻遏蛋白的负调控与CAP的正调控两种机制，互相协调、互相制约色氨酸操纵子与负控阻遏系统结构：色氨酸操纵子中的结构基因区是由trpE、trpD^trpC>trpB>trpA基因构成，紧邻trpE基因的是启动子区（P）、操纵区（0）、前导区（L）和弱化子区（a）o色氨酸操纵子中编码辅阻遏蛋白的基因是trpR,距色氨酸基因簇很远阻遏系统-粗调：色氨酸操纵子的效应物是色氨酸，当培养基屮色氨酸含量较高时，它与辅阻遏蛋白结合后，结合到操纵区，阻止转录；当培养

6、基中色氨酸供应不足时，辅阻遏蛋白不结合色氨酸，从操纵区解离，色氨酸操纵子启动转录。这种调节相当于色氨酸操纵子的粗调开关弱化作用-细调：在前导肽的第10位和第11位上有相邻的两个色氨酸密码子。通过前导肽基因的翻译来调节色氨酸操纵子转录的终止。因为在前导肽基因中有两个相邻的色氨酸密码子，所以前导肽的翻译对色氨酰-IRNA的浓度敏感。分子克隆载体：是一类可供外源DNA插入并携带重组DNA分子进入适当宿主细胞的DNA分子。（1）功能:a.运送外源基因高效转入受体细胞;b・为外源基因提供复制能力;c.为外源基因的扩增提供必要的条件；（2）特点:a.至少有一个

7、复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制;b.至少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入;c.至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞；（3）类型:a、质粒载体（主要讲述）；b、噬菌体载体;c、cosmid克隆载体;d、噬菌粒载体;e、酵母人工染色体载体;f、细菌人工染色体载体；原核生物的两种终止类型1、不依赖于P(rho)因子的终止(强终止子)。特点：(1)发夹结构与poly(U)；(2)二重对称区的转录导致了发夹结构的形成；机制：①发夹结构改变RNA聚合酶构象，使酶停止移动；②DNA、RNA各自形成自身双链使杂交体不

8、稳定而分离；③3'—端一连串U,UA配对最不稳定，易从模板上脱落。强终止子的结构特点：(1)有富含GC的二重对称区；(2)