土壤微生物生物量的测定方法(氯仿熏蒸)

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1、土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取…•仪器分析法）1.1基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h）,土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放岀微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳白动分析仪测定微生物生物量碳含量。根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（Kec），从而计算土壤微生物牛物量碳。1.2实验仪器自动总有机碳（TOC）分析仪（ShimadzuModelTOC—500JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。1.3实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL3）；2）0.5mol

2、/L硫酸钾溶液：称取87gK2SO4溶于1L蒸谓水中3）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L>50ugC/L、70ugC/L、lOOugC/L系列标准碳溶液。（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）1.4操作步骤1.4.1土壤的前处理（过筛和水分调节略）1.4.2熏蒸称取新鲜（相当于干土lO.Og,这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释

3、放岀来的CO?,干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。关闭真空干燥器阀门，于25°C黑暗条件下培养24小时。1.4.2抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min,每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子）,直到土壤无氯仿味道为止。同吋，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。（注意：熏蒸后不可久放，应该快速浸提）探1.4.4浸提过滤从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全

4、转移到80ml聚乙烯离心管中，加入40ml0.5mol/L硫酸钾溶液（土水比为1:4,考虑到土样的原因，此部分熏蒸和不熏蒸土均为4父，即，4乂土：16ml的硫酸钾溶液，当然这个加入量要根据TOC仪器的进入量决定）300r/min振荡30min,用屮速定量滤纸过滤。同时作3个无土壤基质空白。土壤提取液最好立即分析，或一20°C冷冻保存（但使用前需解冻摇匀）（注意这部分很重要，有研究结果表明：提取液如果不立即分析，请保存在一20°C,否则将影响浸提液的效果，其次，过滤时不要用普通的定性或定量滤纸，以免长久杂质会堵塞仪器的管路，建议使用那种一次性塑料注射器，配一个0・2um的滤头

5、，一个才1元）。1.4.5TOC仪器测定吸取上述土壤提取液10ul（这个要根据仪器自己的性能决定，但是一般情况下，在测定土壤滤液时候，要对其进行稀释，如果不稀释，一方面超过原来仪器的标曲，另一方面可能堵塞仪器。）注入自动总有机碳（TOC）分析仪上，测定提取液有机碳含量。由于总有机碳分析仪型号较多，不同的型号则操作程序存在较大差异，这里以本实验室使用的有机碳分析仪（ShimadzuModelTOC—500,JAPAN）为例。1.5计算SMBC=（EcCHCL3—Ecck）*TOC仪器的稀释倍数*原来的水土比/0.451土壤微生物生物量氮(苗三酮比色法)土壤微牛物牛物氮一般占土

6、壤全氮的2%—7%,是土壤中有机一无机态氮转化的一个重要环节，关于土壤微生物氮的测定常见的熏蒸浸提法有两种，一是全氮测定法，另一个是苗三酮比色法，如下2.1基本原理(苗三酮比色法)Amato和Ladd(1988)研究表明新鲜土样熏蒸过程所释放出的氮，主要成分为ot■氨棊酸态氮和钱态氮，这两种氮形态可以用即三酮反应定量测定，并发现熏蒸与未熏蒸土壤提取的萌三酮反应态氮的増量，与其土壤微生物生物量碳Z间存在显著的相关性。因此，人们采用熏蒸提取苗三酮比色法来测定土壤微生物生物量氮(FE-Nnin)o2.2实验仪器分光光度计、硬质试管、水浴锅、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯塑料管、

7、离心管、漏斗等2.3实验试剂1)无乙醇氯仿(CH3C1)；2)0・5mol/L(K2SO4)溶液:称取硫酸钾(K2SO4)87g,溶于去离子水中,稀释至1000ml；3)pH5.2的乙酸锂(LiOH>H2O)溶液：称取氢氧化锂(LiOH-HzO)168g,加入冰乙酸(优级纯)279ml,加水稀释到1000ml,用浓盐酸或50%氢氧化钠溶液调节pH至5.2。4)苗三酮溶液：取150ml二甲基亚飒(C2H6OS)和乙酸锂溶液50ml加入4g水合苗三酮(C9H4O3・H2O)和0.12g述原苗三酮(C18H］o06・2H