汉坦病毒分子流行病学研究及lpompm基因的克隆表达

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1、汉坦病毒分子流行病学研究及"ompM基因的克隆表达硕士研究生：芦殿香导师：陈建平教授中文摘要汉坦病毒(Hantavirus)属于布尼亚病毒科汉坦病毒属，是导致流行性出血热的传染源，其基因组由三个单链片段L,S,M组成，其中L片段编码依赖RNA的RNA聚合酶，S片段编码核衣壳蛋白、M片段编码Gl,G2蛋白。汉坦病毒的分布遍及世界各地，主要由含病毒颗粒的动物呼吸物的气溶胶传播。目前,汉坦病毒的种类不断增加，已报道存在20种以上抗原性及基因型各异的汉坦病毒，其中，汉滩病毒，汉城病毒，普马拉病毒和多布拉伐病毒引起肾综合症出血热，并有六种汉坦病毒和汉坦病毒肺综合症有关。我国是受汉坦病

2、毒危害最为严重的国家，1935年东北部发生了典型的肾综合症出血热，其后该病的临行区域和发病率不断增加。1981至1982年我国学者分别从黑线姬鼠和褐家鼠中分离到汉坦病毒。尽管新的种类的汉坦病毒不断岀现目前在我国流行的汉坦病毒仍然以汉滩病莓和汉城病毒为主。吉林省于1955年首次报道了肾综合症出血热的病例，以后的调查认为吉林省是以姬鼠型汉坦病毒的流行为主，但1998年吉林省爆发了家鼠型流行性出血热⑴，因此本研究选用588份捕获于吉林省的褐家鼠做市材料作为研究对象，希望能为吉林省不同地区褐家鼠的汉坦病毒带毒率的调查及构建吉林省褐家鼠汉坦病毒的分子进化树提供科学依据和研究基础。嗜肺

3、军团菌是一种革兰染色阴性，选择性胞内寄生的细菌。人类感染嗜肺军团菌可引起肺部疾病，以Pontiac热和非典型肺炎症状为主。军团菌可在多种细胞内复制，但在人类以寄生于肺泡巨噬细胞为主。已有关于军团菌外膜蛋白成分是否作为细菌胞内寄生及致病的关键性因素的研究，并且己发现了部分对军团菌胞内寄生；逃避宿主抗原递呈途径及杀灭宿主细胞起重要作用的军团菌的基因I。虽然关于嗜肺军团菌及其它军团菌属的外膜蛋白是否存在共性的报道观点不但一些血清型别的嗜肺军团菌确实含有分子量在25kDa-29kDa的外膜蛋白成份。据Krions报道，把编码嗜肺军团菌25kDa主要夕卜膜蛋白的基因转入大肠杆菌JM8

4、3,表达的蛋白可使非调理素依赖的对U・937细胞的粘附作用较对比组增加5倍以上，应用主要外膜蛋白特异的单克隆抗体可阻断此粘附作用，故认为军团菌25KDa的主要夕卜膜蛋白(MOMP)作为一种粘附因子可介导军团菌粘附到宿主细胞，与军团菌的毒力紧密相关。因此我们选择编码主要夕卜膜蛋白的基因作为研究对象，希望能为研究主要外膜蛋白基因的结构，功能及研制军团菌基因工程疫苗奠定理论基础。本研究分为两部分进行第一部分：以588份捕获于吉林省不同地区的褐家鼠鼠肺材料作为研究对象，利用直接免疫荧光法筛选其中的阳性鼠肺，分析吉林省褐家鼠的汉坦病毒带毒率；并用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)扩增

5、8份吉林省褐家鼠中具有地域代表性的阳性鼠肺汉坦病毒的M和S基因片段，将其与我国及其他国家具有代表性毒株相应的基因片段进行序列对比构建吉林省褐家鼠的分子进化树。第二部分：用PCR技术扩增嗜肺军团菌的主要外膜蛋白抗原基因ompM并克隆入载体PUC18,利用JM109表达此重组质粒后通过SDS-PAGE鉴定所表达的蛋白质。本研究结果表明：在588份吉林省褐家鼠鼠肺中有阳性鼠肺55例，即吉林省褐家鼠汉坦病毒带毒率为9.35%。所构建的吉林省褐家鼠分子进化树的结果证实汉坦病毒与宿主共进化且汉坦病毒的分布具有地理簇集性；同时也成功地克隆并表达了嗜肺军团菌的ompM基因。迄今为止，该研究

6、未见国内外报道。本研究为吉林省褐家鼠汉坦病毒的研究及嗜肺军团菌基因工程疫苗的研究奠定了基础。关键词:吉林省PCR褐家鼠汉坦病毒基因表达嗜肺军团菌ompMResearchofmolecularepidemiologyofHantavirusandclone,expressionofLP.ompMgeneGraduateStudentLuDian-xiangTutorChenJian-pingAbstractHantavirus,theetiologicalagentsofhemontiagicfeverwithrenalsyndrome(HFRS),areclassifie

7、dintheHantavirusgenusinthefamilyBunyaviridae.Likeothervirusesinthefamily,hantaviruseshaveatripartite,single-strandedRNAgenome,ofwhichthelarge(L),medium(M),andsmall(S)segmentsencodetheLProtein(virus-associatedRNApolymerase),virionglycoproteins(G1andG2)andnucleo