自然和工程的紫杉二烯合成酶产紫杉二烯的产量

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1、自然和工程的紫杉二烯合成酶产紫杉二烯的产量前吕紫杉醇（Paclitaxel,又名为Taxol）是一种治疗不同种类的癌细胞或恶性肿瘤细胞的非常有效的抗癌双菇类药物。紫杉醇的來源包括直接从红豆杉树皮屮提取、化学全合成法、半合成法、植物细胞培养分离提取，部分内生真菌也可能会产紫杉醇。直接从红豆杉植物屮提取的紫杉醇产量很低（约lg紫杉醇/每10kg植物组织），因此，从2-4株成熟的红豆杉树木屮获得的紫杉醇的产量还不能满足一个病人。全化学合成紫杉醇技术至少需要40个步骤，尽管现在的技术已经有了很大的进步，但它的产量总体來说还是很低，而且还需要很高的代价。半化学合成法使用紫杉醇合成前体物-10・去乙

2、酰巴卡亭III,该法所用的前体物质仍依赖于植物提取，也需要从植物资源中做大量的纯化工作。红豆杉植物细胞培养技术有很大的发展前景，但是产量生产不稳定、杂质会干扰产物纯化过程。目前，化学半合成和细胞培养是紫杉醇商业供应的主要方法，但是这些方法依然要依靠大量的植物资源，导致紫杉醇的价格增加，而且有限的植物资源无法支持庞大的市场需求。另一方面，产紫杉醇的内生真菌的发现使得用发酵的方法在微生物宿主内产紫杉醇变得可能，不幸的是，数据表明这种方法产紫杉醇的产量依然不稳定而且产量很低，由细菌引起的生物合成途径依然不够清晰。综上，作为一种重要的抗癌药物、但具有昂贵的合成代价以及利用微生物产紫杉醇的广阔前景

3、，已经让无数科研人员研究在不同的宿主内通过代谢工程手段提高紫杉醇的产量做出巨大的努力。紫杉醇生物合成使用最广泛的策略是增加前提物的代谢流，让前体物质积累;这些努力已经发展到克隆必需的基因、明确了前期代谢途径涉及到菇类化合物积累的重要酶，其中包括在紫杉醇生物合成途径中的限速酶一紫杉二烯合成酶。一般而言，菇烯合酶（环化酶）例如紫杉二烯合成酶作用在代谢支流的节点主导着菇类化合物的代谢量，是紫杉醇异源生物合成途径中第一个关键酶酶，该酶催化GGPP合成紫杉醇的三环二菇骨架结构一一紫杉二烯，但是紫杉二烯合成酶在植物屮催化ggpp环化的活性相对于后面的氧化步骤活性很低。这个发现让科学家猜想，如果增加产

4、紫杉二烯的宿主细胞中紫杉二烯合成酶的催化活性可以整体提高紫杉二烯合成酶的产量水平。科学家在包括微生物宿主以及更高级的植物宿主等典型的生物体屮就限速步骤进行重建和代谢工程研究做出了巨大的努力。紫杉二烯合酶功能等生物化学研究近几年也取得很大的进展；包括第一个紫杉二烯合酶的x光结构揭露出这个酶崭新的以及模块化的结构。结构的解析为以后通过蛋片质改造调高酶的催化活性打开了一扇门。紫杉二烯合酶是紫杉醇的生物合成第一个关键酶并且是限速步骤紫杉醇是双话类化合物（巴卡亭III）和苯基异丝氨酸这两个主体结构牛物合成而来。巴卡亭III是由紫杉二烯经过一系列的官能团反应牛成，而紫衫二烯是由犍牛儿基毬牛儿焦磷酸酯

5、（GGPP）前体经过酶促环化反应牛成。紫杉烯合成时各种各样的修饰包括很多的氧化步骤，首先C5位在细胞色素P450单加氧酶催化下梵基化形成紫杉-4（20）,11（12）-二烯-5a-醇。下游生成紫杉醇的过程中还需要C9氧化，杂环丁烷氧化，以及侧链苯基异丝氨酸的处理。侧链是保证紫杉醇抗癌活性的关键因素，侧链的合成由五步反应完成:首先a-苯丙氨酸异构化为卜苯丙氨酸，再与乙酰辅酶A结合，随后由13C-苯丙氨酸侧链-CoA酰基转移酶将其转移到巴卡亭III的C13位的症基上形成疑基酯，最后卜苯丙氨酸的C2和卜氨基分别被梵化和苯甲酰化，形成紫杉醇在已发现的紫衫烷类（大于400种）的基础研究中，紫杉烯的

6、的合成是包括紫杉醇在内的所有紫杉烷生物合成的共同的核心的内容；在早期的研究中，发现从产紫杉烷类的植物中提取分离出的酶，能在氯化镁的存在下，使GGPP转化成紫杉二烯；同位素标记的紫杉二烯被确认转化成了紫杉烷类，比如巴卡亭III和紫杉醇。负责催化GGPP转化成紫杉二烯的酶随后被分离提取出来并命名为紫杉二烯合成酶。紫杉二烯合成酶催化GGPP环化的效率和其他裸子植物的环化酶效率相比很低，因此，Hezari提出此步骤是紫杉醇合成途径的限速步骤。数据表明，紫杉二烯合成酶的活性（学=3.5x103STMT）比其他植物祜类环化酶的活性Km要小两个数量级，具有很慢的周转率。紫杉二烯合成酶性能、工作机理和分

7、子结构1995年Hezari第一次从短叶红豆杉植物中分离开岀紫杉二烯合成酶,它表现出和其他的植物帖烯环化酶相似的性能，都需要M/+的催化作用，最佳的催化性能是在微碱性环境，分子量在lOOKDao随后，紫杉二烯合成酶在大肠杆菌中作为可溶性酶表达，并通过疑磷灰石色谱和离子交换色谱纯化。和大多数植物二帖烯合酶的普遍特点一样，紫杉二烯合成酶蛋白序列有三个阿尔法螺旋结构域。C端区域和I类祜类合成酶（法尼基二磷酸合酶、GGPP合成酶）相似；两个