人抗单核细胞抗体(ama)

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1、人抗单核细胞抗体（AMA）ELISA试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用预期应用ELISA法定量测定人血清、血浆或其它相关液体中抗内皮细胞抗体（AMA）含量。实验原理本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中AMA水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入AMA抗原、生物素化的抗人AMA抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的AMA呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定

2、吸光度（OD值），计算样品浓度。试剂盒组成及试剂配制1.酶联板：一块（96孔）标准品（冻干品）：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为1000U/mL，做系列倍比稀释后，分别稀释成1000U/mL，500U/mL，250U/mL，125U/mL，62.5U/mL，31U/mL，15.6U/mL，其原液直接作为最高标准浓度，样品稀释液直接作为标准浓度0U/mL，临用前15分钟内配制。如配制500U/mL标准品：取0.5ml1000U/mL的上述标准

3、品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。2.样品稀释液：1×20ml/瓶。3.检测稀释液A：1×10ml/瓶。4.检测稀释液B：1×10ml/瓶。5.检测溶液A：1×120ul/瓶（1：100）临用前以检测稀释液A1：100稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔100ul），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如1ul检测溶液A加99ul检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。6.检测溶液B：1×120ul/瓶（1：100）临用前

4、以检测稀释液B1：100稀释。稀释方法同检测溶液A。7.底物溶液：1×10ml/瓶。8.浓洗涤液：1×30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。9.终止液：1×10ml/瓶（2NH2SO4）。标本的采集及保存1．血清：标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000xg离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。2．血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2-8°C1000xg离心15分钟，或将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。注：标本溶血会影响最后检测结果

5、，因此溶血标本不宜进行此项检测。操作步骤各试剂在使用前平衡至室温。1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。除空白孔外，余孔分别加标准溶液或待测样品100ul，注意不要有气泡，轻轻混匀，酶标板加上盖，37℃反应120分钟。2.弃去液体，甩干，不用洗涤。3.每孔加检测溶液A工作液100ul，37℃,60分钟。洗板3次，350ul/每孔，甩干。4.每孔加检测溶液B工作液100ul，37℃，60分钟，洗板5次，甩干。5.依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光显色30分钟（此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度

6、兰色，后3-4孔梯度不明显）。6.依序每孔加终止溶液50ul，终止反应（此时兰色立转黄色）。用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。注：1．每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是最后加底物溶液及2NH2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。2．为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内。洗板方法手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.4ml注入孔内，浸泡1-2分钟，根据需要，重复此过

7、程数次。自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。特异性本试剂盒可同时检测重组或天然的人AMA，且与其它相关蛋白无交叉反应。计算以标准物的浓度为横坐标（对数坐标），OD值为纵坐标（普通坐标），在半对数坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。注意事项1．洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。2．一次加样时间最好控

8、制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。3．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。4．如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请最后乘以稀释倍数。5．在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。6．底物请避光保存。说明1.在储存及孵育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶盖须盖紧以防止蒸发和污染，试剂避免受到微生物的污染，因为蛋白水解酶的干扰将导致出现错误的结