“苏云金杆菌”工业发酵生产工艺中试报告

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1、苏云金杆菌工业发酵生产工艺中试报告衡阳莱德生物药业有限公司（张明剑、张孝秀、陈卫国）2002年6月在湖南师大生命科学院的支持和指导下，本公司于2000年6月至2001年底进行了“苏云金杆菌”液体发酵生产工艺的中试工作。一、中试一开始，我们提岀以下三个目标：（1）根据本地资源，筛选出符合“苏云金杆菌”生产的最佳培养基配方。（2）探索“苏云金杆菌”工业液体发酵生产的最佳工艺条件。（3）提高放罐液含量，降低生产成本。围绕实现这三个目标，我们进行了一系列的试验工作。二、试验方法与过程根据试验的三个目标要求，我们对“苏云金杆菌”发酵工艺的关键培养基配方，后处理工艺的过滤、防腐工艺、包装工艺和质检工

2、艺进行了全面的试验。对培养基配方的屮试分为两阶段进行，第一阶段为摇瓶试验阶段。我们在湖南师大生命科学院提供一般细菌发酵配方原则的原始配方基础上,对原配方中氮源部分的花生饼粉、玉米浆、碳源部分的糊精、豆油这些本地不易购到的原料，用本地易购到的黄豆饼粉、菜籽饼粉、糠饼粉、蚕蛹粉和玉米粉、红茹淀粉进行取代和调整，在500毫升-:角瓶屮和摇床上进行发酵，共做了十五个配方的实验（见表一、表二）。第一次做了十二个配方处理的实验，其中十个为种子培养基配方处理，二个为发酵培养基配方处理，每个处理重复三次，每瓶装培养液60毫升。第二次在第一次摇瓶试验的基础上，做了8个配方的试验（其中五个为第一次试验中挑选

3、出来的配方处理进行重要试验，三个为新增的发酵培养基配方处理）重复三次，每瓶装量为60毫升。培养温度为30°C〜34°C,发酵17小时后在无菌室用吸管吸取1毫升发酵液于装有99毫升无菌水的三角瓶中，玻璃珠打碎后用血球计数板在显微镜下检查计数。第二阶段为实罐实验阶段。在摇瓶试验的基础上，筛选出利用本地原材料而发酵液含量高，成本低的配方处理进行种子罐（3000立升）一级发酵和15000立升发酵罐两级发酵。种子罐一级发酵两个配方处理（即处理8#、处理10#）,共两罐批，15000立升发酵罐配方采用处理12,共9罐批，种子罐与发酵罐于接种后4小时取样观察，以后每2小时取样一次,用显物镜在油镜下观察

4、其形态变化和用血球计数板测其含菌数，晶体形成，芽砲少量脱落时即可放罐。两级发酵时，种子罐的培养温度为30°C〜32°C,发酵罐前期0〜12小时温度为30°C〜32°C,12小时后为34°C,通气量4小时后逐步加人至1：0.8-1：1,12小时后适当减小。过滤工艺试验目的是:在保证产品质量的前提下,定出最佳过滤方法。分三个处理：即120〜14尼龙帆布过滤处理，双层纱布过滤处理和发酵液不过滤作对照。方法是取发酵液样品，稀释100倍，在150倍显微镜下用血球计数板计数,然后将样品用尼龙帆布和双层纱布分别在洁净的玻璃漏斗上过滤，将滤液分别在150倍显微镜下用血球计数板计数，重复三次。分别取滤液1

5、0毫升，在离心机上3000转离心5分钟，观离沉淀物体积,取滤液分别用背包式喷雾器作喷雾试验，记录下结果。防腐工艺试验目的：主要是测定加大防腐剂苯甲酸钠至0.5%后对芽砲萌芽的抑制作用。方法是对成品定期取样制片，于显微镜下观察产品芽抱情况和杂菌感染情况。一年后对同一成品用血球计数板计数后，再做平板计数，测定其芽抱活力，重复两次。包装工艺试验目的是保证产品质量，克服产品由芽砲的沉降引起含量不均匀的缺点。方法是取同一批号产品在空气鼓动情况下包装成品十件,每件取一瓶分别稀释100倍后，在150倍显微镜下用血球计数板计数，记录下结果。并取不同批号的产品3瓶，不摇动情况下分别测其上下层和摇动后测其混

6、合均匀的含量作为对照。质检工艺试验的目的是定出最佳质检方法，要求可靠、迅速、简便、易行。分两个处理：即血球计数板处理和平板培养计数法，十次重复。血球计数板计数方法同前。平板培养采用细菌培养基，将成品稀释10倍，在32°C下恒温培养24小时以后观察计数菌落数。三、结果分析（-）发酵培养基的试验1、摇床试验经两次摇床试验，证明釆用黄豆饼粉、菜饼粉代替花生饼粉，用菜油或糠油代替豆油，用淀粉代替糊精是完全可行的。发酵结果证明：含菌数完全可以超过原配方。试验数据详见表一、表二。根据实验数据分析，得出以下结论：（1）种子培养基配方以处理8#、10#为最好。含菌数量高，分别达45亿/毫升和47亿/毫升

7、。（2）发酵配方以处理12、15为最好，含菌分别达80亿/毫升和65.6亿/毫升，经多重比较分析（LSR法）表明，处理12与原配方（处理14）差异极显著（见表三）。（3）各种配方处理试验结果表明（见表一）种子培养原配方（处理1）含菌数均低于处理6、7、8、9、10,发酵培养原配方（处理14）含菌数均低于处理12、13、15、16o(4)从试验结果看出：配方中含有黄豆饼粉作氮源加豆油的效果最差。处理2[I卩为此配方，从表三所列的多重比