医学真菌实验室常规检查方法

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1、万方数据医学真菌实验室常规检查方法余进李若瑜真菌感染的日益增多已成为广大临床医师的共识，这一现状对微生物实验室真菌检查技术也提出了更高的要求。规范的标本取材、保存、处理以及正确的真菌镜检和培养方式可以提高阳性率检出，对临床诊断和治疗提供有价值的帮助。笔者就标本取材、真菌镜检和真菌培养的操作规范以及致病真菌鉴定原则进行简要的介绍。一、各种标本的取材要求标本的种类和质量是决定分离和鉴定病原真菌成败的最基本因素。规范的采集方法是开展各项实验室检查的基础。检验医师应正确掌握各种标本的采集、处理方法，得到高质量的临床标

2、本。用于真菌学检查的标本采集大部分与细菌学检杳取材要求一致，如血液、尿液、痰液、支气管肺泡灌洗液、胸腔积液、腹腔积液、脑脊髓液、关节腔积液和组织等。特殊部位，如甲、皮肤、毛发、角膜、黏膜等取材时有特殊要求⋯。甲标本采集前用70％酒精彻底清洁病甲，钝刀用火焰灭菌，冷却后从甲变色、萎缩或变脆的部位、健甲与病甲的交界处取材，保证一定深度，最好能达到甲板腹侧，标本量应足够大，可以在平皿中接种8～10个部位。对于伴有甲沟炎患者的取材，应采用棉拭子，70％酒精清洁局部后沾取损害分泌物。皮屑标本采集前用70％酒精清洁取材区

3、域，钝刀火焰灭菌，冷却后从损害的边缘向外刮取或用剪刀剪去疱顶。如果鳞屑量较少，可采用透明胶带法取材旧J，将透明胶带黏着面紧压于损害之上，然后剥下，将黏着面向下贴在透明载玻片上送检。毛发采集时选择无光泽毛发或者在毛囊口折断的毛发。先将镊子用火焰灭菌，然后用镊子将毛发从头皮拔除，尽量保留毛根部。口腔黏膜可用钝刀刮片或拭子取材，阴道黏膜可用拭子取材，一般不用浸湿。对疑诊真菌性角膜溃疡的取材应用灭菌小匙或钝刀刮取溃疡部位，应自溃疡的基底和其边缘取材。由于标本量往往有限，最好在取材同时进行平皿培养和涂片镜检。对于引流脓

4、肿或溃疡脓液，用钝刀尽可能从损害的深部取材，非引流的皮下脓肿或窦道中的脓液要用无菌注射器从脓疡中抽吸，并将抽吸物装入无菌容器中。如脓液中有颗粒(见于足菌肿)应注意收集。如果窦道开口部位有翘起的痂屑，通常在其下方的脓液中可发现颗粒。标本在采集后应该尽快送检，在无菌、防渗漏的容器中运输，最好在1-2h内进行真菌镜检并转种在初级分离培养基上。甲屑和毛发可以在干燥的环境中保存数El。DOI：IO．3760／enmj．isan．1009-9158．2009．01．034作者单位：100034北京大学第一医院北京大学真菌

5、和真菌病研究中心．继续教育．二、真菌镜检对临床标本的直接显微镜检查是最简单也是很有价值的实验室诊断方法。其优点在于简便、快速，无菌部位的阳性结果可直接确定真菌感染。但是由于阳性率较低，阴性结果亦不能排除诊断。直接镜检对于浅表和皮下真菌感染最有帮助。在皮肤刮屑、毛发或甲标本中发现皮肤癣菌、念珠菌和马拉色菌的成分可提供对相应真菌病的可靠诊断。如在无菌体液的直接镜检中发现真菌成分常可确立深部真菌病的诊断，例如在脑脊髓液中检测到带荚膜的新生隐球菌酵母细胞，或外周血涂片中检测到荚膜组织胞浆菌细胞。但一般在有菌部位只有发

6、现大量真菌菌丝方才有意义，通过直接镜检一般可以区分念珠菌、隐球菌、暗色真菌、毛霉(接合菌)等菌的感染，进一步明确鉴定菌种需要通过培养鉴定来完成。直接镜检一般方法¨1是将标本置于载玻片上，加一滴浮载液，盖上盖玻片，放置片刻或微加热，即在火焰上快速通过2～3次，不应使之沸腾，以免结晶。然后轻压盖玻片，驱逐气泡并将标本压薄，用吸纸吸去周围溢液，置显微镜下检查。检查时应遮去强光，先在低倍镜下检查有无菌丝和孢子，然后用高倍镜观察孢子和菌丝的形态、特征、位置、大小和排列等。采集的标本也可涂在载玻片上，空气干燥后，经革兰染

7、色、银染等方法染色后观察。真菌镜检常用浮载液有氢氧化钾溶液、生理盐水(或水)、墨汁、乳酸酚苯胺蓝(棉蓝)染液和Park墨水等。氢氧化钾溶液在浅部真菌感染的直接镜检中最为常用。一般使用溶液浓度为10％～20％。氢氧化钾可消化蛋白质并使角化组织透明，因而可以更清楚地观察到标本中的真菌。真菌胞壁的几丁质对检测浓度的氢氧化钾有一定的抵抗作用，但一定时间之后真菌也会溶解。因此，氢氧化钾可用于各种临床标本的检查⋯。生理盐水(或水)可直接观察黏膜或组织碎块，缺点是易于干燥，只适于短时间检查⋯。墨汁涂片用于检测脑脊髓液中新生

8、隐球菌(图1)，墨汁不能使隐球菌荚膜多糖着色，但可提供黑色背景而使荚膜更亮而易于观察pJ。乳酸酚棉蓝染液是真菌镜检的标准浮载剂。棉蓝系酸性染料，能使真菌着色呈蓝色；乳酸对真菌有杀灭作用，含有甘油，能使涂片保存相当的时间，也是常用的封固保存液。Park墨水染色法H1由20％氢氧化钾溶液和派克墨水各半混合而成，为马拉色菌的常用染色方法(图2)。氢氧化钾用于溶解鳞屑角质，如果染纯培养的菌则可用蒸馏水代替氢