几种超高分辨率荧光成像方法的原理及进展

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1、NewTechniques新技术讲座生物化学与生物物理进展ProgressinBiochemistryandBiophysics2009,36(12):1626~1634www.pibb.ac.cn几种超分辨率荧光显微技术的原理和近期进展*1)2)1)2)**吕志坚陆敬泽吴雅琼陈良怡(1)北京市科学技术情报研究所，北京100044；2)中国科学院生物物理研究所，北京100101)摘要在生命科学领域，人们常常需要在细胞内精确定位特定的蛋白质以研究其位置与功能的关系．多年来，宽场/共聚焦荧光显微镜的分辨率受限于光的阿贝/瑞利极限，不能分辨出200nm以下的结构．近年来，随着新的荧光探针和成像

2、理论的出现，研究者开发了多种实现超出普通共聚焦显微镜分辨率的三维超分辨率成像方法．主要介绍这些方法的原理、近期进展和发展趋势．介绍了光源的点扩散函数(pointspreadfunction,PSF)的概念和传统分辨率的定义，阐述了提高xy平面分辨率的方法．通过介绍单分子荧光成像技术，引入了单分子成像定位精度的概念，介绍了基于单分子成像的超分辨率显微成像方法，包括光激活定位显微技术(photoactivatedlocalizationmicroscopy,PALM)和随机光学重构显微技术(stochasticopticalreconstructionmicroscopy,STORM)．介绍

3、了两大类通过改造光源的点扩散函数来提高成像分辨率的方法，分别是受激发射损耗显微技术(stimulatedemissiondepletion,STED)和饱和结构照明显微技术(saturatedstructureilluminationmicroscopy,SSIM)．比较了不同的z轴提取信息的方法，并阐述了这些方法与xy平面上的超分辨率显微成像技术相结合所得到的各种三维超分辨率显微成像技术的优劣．探讨了目前超分辨率显微成像的发展极限和方向．关键词超分辨率荧光显微技术，点扩散函数，PALM，STORM，STED，SSIM学科分类号Q27，Q63DOI:10.3724/SP.J.1206.2

4、009.00242现代生物医学研究中为了更好地理解人体生命胞器微小结构的演化，而并不影响生物体系的生物的作用过程和疾病的产生机理，需要观察细胞内细活性．胞器、病毒、寄生虫等在三维细胞空间的精确定位近年来，随着新型荧光分子探针的出现和成像和分布．另一方面，后基因组时代蛋白质科学的研方法的改进，光学成像的分辨率得到极大的改进，究也要求阐明：蛋白质结构、定位与功能的关系以达到可以与电子显微镜相媲美的精度，并可以在活及蛋白质-蛋白质之间发生相互作用的时空顺序；细胞上看到纳米尺度的蛋白质[2～5]．这些技术上的生物大分子，主要是结构蛋白与RNA及其复合进步势必极大地推动生命科学的发展，为了增强生物

5、，如何组成细胞的基本结构体系；重要的活性因物学家对于超分辨率荧光显微成像(super-resolution子如何调节细胞的主要生命活动，如细胞增殖、细fluorescentmicroscopy)机理的理解，以下我们将介胞分化、细胞凋亡与细胞信号传递等．反映这些体绍传统的荧光显微成像的极限，突破此极限超分辨系性质的特征尺度都在纳米量级，远远超出了常规率成像的原理以及目前国际上的最新进展.的光学显微镜(激光扫描共聚焦显微镜等)的分辨极1荧光显微成像的极限限(xy向分辨率：200nm，z向分辨率：500nm)[1].应用传统的电子显微镜(EM)可以达到纳米量级的根据瑞利/阿贝准则，光学显微镜的

6、分辨率定分辨率，能够观察到细胞内部囊泡、线粒体等细胞器的定位，但是由于缺乏特异性的探针标记，不适*北京市财政专项(PXM2009_178214_077580)，北京市科学技术研合定位单个蛋白质分子，也不适合观察活细胞和细究院改革与发展专项和国家重点基础研究发展计划(2006CB705706)胞膜的动态变化过程．因此，生物学家迫切希望有资助项目.**通讯联系人.一种实验显微方法，它既具有亚微米甚至纳米尺度Tel:010-64888524,E-mail:chen_liangyi@yahoo.com的光学分辨本领，又可以连续监测生物大分子和细收稿日期：2009-04-16，接受日期：2009-

7、08-252009;36(12)吕志坚等：几种超分辨率荧光显微技术的原理和近期进展·1627·义为用显微镜可以分辨出来的两个同等亮度的点光多点光源的时候，很难突破光学分辨率的极限来进源之间的最小距离，而此分辨率的极限是由光的衍行精确定位．而当显微镜的物镜视野下仅有单个荧射特性所决定的．无论是宽场显微镜还是共聚焦显光分子的时候，通过特定的算法拟合，此荧光分子微镜，单个点光源经过透镜组和物镜汇聚后都会在位置的精度可以很容易超过光学分辨率