超分辨率荧光显微技术的原理和进展

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1、超分辨率荧光显微技术的原理和进展姓名：曹宁学号:104753141002专业：药理学2015年2月超分辨率荧光显微技术的原理和进展摘要：在生命科学领域，人们常常需要在细胞内精确定位特定的蛋白质以研究其位置与功能的关系。多年来，宽场/共聚焦荧光显微镜的分辨率受限于光的阿贝/瑞利极限，不能分辨出200nm以下的结构。近年来，随着新的荧光探针和成像理论的出现，研究者开发了多种实现超出普通共聚焦显微镜分辨率的三维超分辨率成像方法．主要介绍这些方法的原理、近期进展和发展趋势。史蒂芬·赫尔（Stefanw．Hell）、埃里克·

2、本茨格（EricBetzig）和威廉·默尔纳（WilliamE.Moerner）因在超分辨率荧光显微技术方面的贡献共享了2014年的诺贝尔化学奖。他们使用荧光分子和特殊的光物理原理，巧妙地突破了普通光学显微镜无法突破的“阿贝极限”，其开创性的成就使光学显微技术发展为“显纳”技术，能够窥探纳米世界。关键词：超分辨率荧光显微技术，光激活定位显微技术，随机光学重构显微技术，点扩散函数现代生物医学研究中为了更好地理解人体生命的作用过程和疾病的产生机理，需要观察细胞内细胞器、病毒、寄生虫等在三维细胞空间的精确定位和分布．另一

3、方面，后基因组时代蛋白质科学的研究也要求阐明：蛋白质结构、定位与功能的关系以及蛋白质-蛋白质之间发生相互作用的时空顺序；生物大分子，主要是结构蛋白与RNA及其复合物，如何组成细胞的基本结构体系；重要的活性因子如何调节细胞的主要生命活动，如细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡与细胞信号传递等．反映这些体系性质的特征尺度都在纳米量级，远远超出了常规的光学显微镜(激光扫描共聚焦显微镜等)的分辨极限(xy向分辨率：200nm，z向分辨率：500nm)[1].应用传统的电子显微镜(EM)可以达到纳米量级的分辨率，能够观察到细胞内部囊

4、泡、线粒体等细胞器的定位，但是由于缺乏特异性的探针标记，不适合定位单个蛋白质分子，也不适合观察活细胞和细胞膜的动态变化过程．因此，生物学家迫切希望有一种实验显微方法，它既具有亚微米甚至纳米尺度的光学分辨本领，又可以连续监测生物大分子和细胞器微小结构的演化，而并不影响生物体系的生物活性．近年来，随着新型荧光分子探针的出现和成像方法的改进，光学成像的分辨率得到极大的改进，达到可以与电子显微镜相媲美的精度，并可以在活细胞上看到纳米尺度的蛋白质[2～5]．这些技术上的进步势必极大地推动生命科学的发展，为了增强生物学家对于超

5、分辨率荧光显微成像(super-resolutionfluorescentmicroscopy)机理的理解，以下我们将介绍传统的荧光显微成像的极限，突破此极限超分辨率成像的原理以及目前国际上的最新进展.1.光学显微镜与阿贝极限最简单的光学显微镜由2个凸透镜组成，它利用的就是凸透镜能将物体的像放大的原理。在此之后，荷兰微生物学家安东尼·范·列文虎克（AntonievanLeeuwennhoek）和英国物理学家罗伯特·虎克（Roberthooke）对物体的成像原理进行了深入研究，并改进了显微镜的结构，发明了调焦系统、照

6、明装置和载物台，制造出了具有现代雏形的光学显微镜［32］。他们利用改进后的光学显微镜做了一系列生物学观察实验。1873年德国显微技术专家恩斯特·阿贝（ErostAbbe）揭示了光学显微镜由于光的衍射效应和有限孔径分辨率存在极限的原理［33］。根据点扩散函数简称PSF，是一个无限小物点通过光学系统在像平面处的光强分布函数［3］，也可以理解为艾里斑的光强分布函数），艾里斑的大小可以用其半高宽／半宽度（fullwidthathalfmaximum，简称FWHM）来表示。在垂直于光传播方向的平面上（x，y平面），其半高宽大

7、约为（Δx，Δy）＝λ/2nsina＝λ/2NA，在光传播的方向上（z轴），其半高宽大约为Δz＝2λ/2nsin2n[9]。其中λ是入射光的波长，n是介质的折射率，a是物镜的半孔径角度，NA是物镜的数值孔径。分辨率不仅与光斑的半高宽相关，还与成像的对比度有关．以xy平面为例，对比度的概念是：在两个同样亮度的点光源光斑中间存在亮度的最小值，而点光源光斑的中心为亮度的最大值，此两值之间的差与亮度最大值的比值即为对比度．当两个点光源光斑距离靠近时，对比度下降，而距离分开时，对比度上升，其分布范围在0～1之间．瑞利分辨率(

8、r)的概念是：在理想的光学成像环境下，当两个点光源光斑的对比度为26.4%时，两个光斑中心点之间的距离即为瑞利分辨率．将显微镜的光斑在xy平面上的分布用二维的贝塞尔函数或是高斯函数来拟合(点扩散函数pointspreadfunction,PSF)[34]，计算对比度为26.4%时光斑的距离，就可以得到瑞利分辨率．宽场荧光成像时xy平面的分辨率为rx,y=0.