何水林版基因工程第四章 基因工程的主要技术与原理

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1、第四章基因工程的主要技术与原理周毅峰2013.03核酸的提取与纯化核酸电泳分子杂交PCR技术DNA序列分析大分子相互作用1、核酸的提取与纯化破碎细胞或包膜－内容物释放材料准备核酸分离、纯化沉淀或吸附核酸，并去除杂质核酸溶解在适量缓冲液或水中20－60bp1.1、基因组DNA的提取与纯化DNA溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂DNA钠盐比游离态更易溶于水DNP在0.14mol/LNaCl中的溶解度是水中的1%DNP在1mol/LNaCl中的溶解度是水中的2倍生物材料的准备新鲜，或者冻存的样品液氮中研磨加缓冲液EDT

2、A螯合Mg2+、Ca2+SDS变性蛋白质β-巯基乙醇、DTT打开二硫键和抗氧化PVP与酚和多糖结合及抗氧化裂解细胞除杂加CTAB或SDS结合多糖和蛋白加酚仿去蛋白纯化与保存加乙醇或异丙醇沉淀加乙醇反洗涤吹干水或TE溶解－20℃保存基因组DNA的提取---酚抽提法样品的准备细胞的裂解蛋白质变性DNA的抽提DNA的沉淀血基因组DNA试剂盒酵母基因组DNA试剂盒细菌基因组DNA试剂盒细胞基因组DNA试剂盒CTAB法流程图植物材料裂解液上层溶液液氮研磨抽提细胞裂解干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液SDS法流程图（以动物组

3、织为例）动物组织细胞裂解上层溶液组织匀浆抽提干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物浓盐法：有机溶剂抽提法：密度梯度离心法：核酸分离、纯化蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等）高盐洗涤蛋白酶处理多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5MNaCl，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯

4、苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μLDNA液中加入200μl20%PEG8000(含1.2MNaCl)，冰浴20min。核酸分离、纯化多酚的去除：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合核酸分离、纯化盐离子的去除：70％的乙醇洗涤CTAB溶液配制好备用，65℃水浴预热。猕猴桃叶片或果实采取后最好立即放到液氮中,避免酚类物质

5、氧化65℃水浴一个小时氯仿：乙醇：异戊醇=80:16:4的抽提液两次。10000转/分离心20分钟，尽量把丝状物压紧，避免吸取上清时有丝状物牵拉等体积预冷的异丙醇，75%乙醇洗去其他杂质。洗两次。用无水乙醇5毫升洗一次。晾干5分钟挥发掉乙醇后加入3-5mlTE溶解，加入5ul,1mg/ml的RNA酶后保存猕猴桃DNA提取实例CTAB提取缓冲液的改进配方组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClCTABPVP40β-巯基乙醇终浓度100mM20mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/

6、V）使用前加入猕猴桃基因组DNA闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；原理1.2、碱裂解法提取质粒DNADNA双链变性DNA单链复性强碱中性染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质—SDS复合物结合在一起；当K+取代Na+时,生成不溶的PDS，这些复合物从溶液中沉淀下来。变性利用宿主菌线状染色体DNA与闭环双链质粒DNA的结构状态的差异来提取质粒DNA。当同时碱变性时，线状基因组DNA变性充分而质粒DNA处于拓扑缠绕的自然状态而不能彼此分开。当条件恢复时（

7、酸中和），质粒DNA迅速准确配置重新形成完全天然超螺旋分子，而线状DNA则与破裂的细胞壁，细菌蛋白相互缠绕成大型复合物，被SDS包盖。当K+取代Na+时,这些复合物会从溶液中沉淀下来，附在细胞碎片上一起被离心除去。碱裂解法所用的试剂作用①葡萄糖增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力（震荡）的作用而降解。②EDTAMg2+、Ca2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。③NaOH-SDSNaOH：强碱，提供pH>12的碱性条件，使DNA双链变性。SDS:溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋

8、白—SDS”复合物，使蛋白质（包括DNA酶）变性沉淀。冰醋酸把醋酸钾溶液的pH调到4.8。用来中和NaOH变性液，使DNA复性。高浓度的K+置换Na+，生成不溶的PDS用于沉淀DNA。⑤乙醇DNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境。④KAc-HAc缓冲液⑥RNaseA降解RNA渣滓。以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。⑦TE缓冲液DNA保存液。由