基因工程的主要技术原理

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1、第二章基因工程的主要技术原理1、Southernblot双链DNA限制性内切酶消化电泳分离检测放射自显影转膜NaOH变性洗膜杂交标记的探针NaOH或高温变性原理和方法:五.分子杂交技术应用:基因拷贝数检测;基因文库筛选,获取目的基因;遗传疾病诊断;转基因样品检测,等…2、Northernblot是相对于Southernblot而命名的。利用DNA-RNA链或RNA-RNA链杂交的原理，通过DNA（或RNA）探针检测RNA样品。原理和方法:单链RNA变性胶电泳分离检测放射自显影转膜洗膜杂交标记的探针NaOH或高

2、温变性应用:主要用于基因在转录水平上的表达研究。基因时空特异性表达，及表达模式分析；候选基因表达分析，有利于排除候选基因，等…Pi36-1Pi36-2RiceGAAS预测CRG2(2)CRG3(0)CRG4(0)5.8kb4.8kb6.4kbabc物理图谱NBS-LRRNBS-LRRRM5647(5)Northernblot的原理与Southernblot相比有三点不同:(1)检测的对象不同.(2)变性方法是不同的,它不能用碱变性,因为碱变性会导致RNA的降解.(3)探针不同.3、Westernblot通过抗

3、体与靶蛋白的抗原特异性反应检测蛋白质样品。主要用于基因在蛋白质水平上的表达研究。Westernblot的原理与Southernblot相比有两点不同:(1)检测的对象不同.(2)探针的性质不同,在Westernblot中使用的探针是抗体(蛋白质)将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。一、基因文库的构建1.基因文库（genelibrary）第五节基因文库构建（2）目

4、前常用的载体2.构建基因文库的载体选用载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。（1）对载体的要求载体系列：容量为24kpcosmid载体：容量为50kbYAC：容量为1MbBAC:容量为300kb断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法。（1）染色体DNA大片段的制备3.基因文库构建的一般步骤超声波（300bp）或机械搅拌（8kb）。①物理切割法：内切酶Sau3A进行局部消化。可得到

5、10-30kb的随机片断。②酶切法：（2）载体与基因组DNA大片段的连接①粘性末端直接连接载体与外源DNA大片段的两个末端都有相同的粘性末端。如：Sau3A与BamHI的酶切末端。直接连接、人工接头或同聚物加尾。②人工接头法（adapter）人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。各种酶的接头可以向公司定做或购买。接上人工接头粘性末端CCCCCC末端转移酶粘性末端③同聚物加尾4.基因组文库的大小一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目。N=ln(1-p)ln(1-f)p:文库包含了整个基因组DNA的概

6、率（99%）f:插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因组DNA的百分数N：所需的重组载体数（克隆数）例如：人的基因组是3×109bp，插入DNA片断的平均长度如果是1.7×104bpN=ln(1-p)ln(1-f)=ln(1-99%)ln(1-f)=4.61×GfN=4.61×GfG：Genome大小；f：fragment大小N=4.61×Gf=4.61×3×1091.7×104=8.1×1051.cDNA以mRNA为模板逆转录出的DNA称cDNA。2.cDNAlibrary二、cDNA文库的构建mRNAc

7、DNA3’3’5’5’反转录酶引物利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称cDNA文库。（1）不含内含子序列。（2）可以在细菌中直接表达。（3）包含了所有编码蛋白质的基因。（4）比DNA文库小的多，容易构建。4.构建cDNA文库的一般步骤（1）总RNA（totalRNA）提取3.cDNA文库的特点提取总RNA有商业化的试剂盒（kit）。分离mRNA用商业化的OligodT纤维柱。利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tR

8、NA等）中分离纯化。mRNA只占总RNA的1%-2%。（2）mRNA的分离纯化①原理②mRNA的分离纯化Column（柱）反转录酶（3）cDNA的合成①cDNA第一链合成逆转录酶能以RNA为模板合成DNA。用OligodT（或随机引物）作引物，合成cDNA的第一链。mRNAcDNA3’5’5’AAAAAAATTTTTTTOligodT引物用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mRN