CBLL1在非小细胞肺癌中高表达并促进细胞的增殖和侵袭

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1、分类号：R734.2单位代码：10159密级：公开学号：201210051博士学位论文中文题目：CBLL1在非小细胞肺癌中高表达并促进细胞的增殖和侵袭英文题目：CBLL1ishighlyexpressedinNon-SmallCellLungCancerandpromotescellproliferationandinvasion论文作者：惠林萍指导教师：邱雪杉教授学科专业：病理学与病理生理学完成时间：2018年11月中国医科大学博士学位论文CBLL1在非小细胞肺癌中高表达并促进细胞的增殖和侵袭CBLL1ishighlyexp

2、ressedinNon-SmallCellLungCancerandpromotescellproliferationandinvasion论文作者惠林萍指导教师邱雪杉教授申请学位医学博士培养单位基础医学院一级学科基础医学二级学科病理学与病理生理学研究方向肺癌论文起止时间2013年9月—2018年11月论文完成时间2018年11月中国医科大学（辽宁）2018年11月中国医科大学博士学位论文摘要目的：CBLL1是最近被发现的一个E3泛素连接酶，它含有RING-finger结构域。E-cadherin是典型的钙粘蛋白成员，它的缺失

3、与癌的预后不良相关。CBLL1蛋白被确认为结合酪氨酸磷酸化的E-cadherin，介导其内化和随后的泛素依赖的降解从而改变细胞间接触。研究证明CBLL1在肿瘤发生中起多种作用。首先，CBLL1被报道可以诱导锚定-依赖的细胞生长；此外，在人类结肠癌组织中CBLL1在癌组织与正常组织相比表达明显增加。其次，在CBLL1过表达的上皮细胞表达E-cadherinshRNA不促进尖突起的形成，这表明CBLL1以E-cadherin非依赖的方式影响细胞的表型。CBLL1影响细胞对基质的粘附和MDCK上皮细胞的侵袭能力。在结直肠上皮细胞中，

4、自分泌的Slit-Robo通路促进CBLL1介导的E-cadherin下调促进癌的发生。这些研究表明CBLL1可能是肿瘤进展中重要信号通路的下游蛋白，目前需要更多的研究来阐明CBLL1作为一个潜在的治疗靶点的作用。此外，CBLL1可以增加RNA结合蛋白PSF与癌症相关的蛋白质正常编码的mRNA结合的能力，并且促进MDCK细胞增殖。而在ERα依赖的乳腺癌MCF-7细胞中，CBLL1过表达可抑制雌激素依赖的细胞增殖和迁移。此外，东莉洁等研究发现CBLL1可以抑制HIF-1α/VEGF通路活性。总之，CBLL1在肿瘤形成中的潜在作用

5、还需要进一步的研究。基于上述理由我们推测，CBLL1与癌症的进展有着密切的关系。为了验证我们的推测，探讨CBLL1对非小细胞肺癌的生物学作用，我们采用免疫组织化学方法检测CBLL1在非小细胞肺癌和癌旁肺组织中的表达，并结合临床资料分析其与临床病理特征之间的关系，上调和干扰CBLL1后对肺癌细胞增殖、侵袭的影响，探讨其可能的分子机制，为肺癌的早期诊断和治疗提供新的靶点。研究方法：1.肺癌组织标本本研究选取了中国医科大学附属第一医院2009年1月到2013年12月的79例肺癌组织和24例癌旁肺组织石蜡标本，均来自肺癌外科手术切除的

6、患者，所有患者在手术前未接受放疗或者化疗。2.免疫组织化学染色、结果判定组织切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精脱苯、水化后，采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶法检测CBLL1蛋白表达。I中国医科大学博士学位论文3.细胞培养人支气管上皮细胞HBE、肺腺癌细胞A549、H1299、SPC-A-1、H157。4.siRNA干扰和细胞转染根据siRNA设计原则，选取人CBLL1mRNA中的特异性核苷酸片段为靶目标，由上海吉玛基因化学技术有限公司合成。分为非特异性siRNA转染组和特异性siRNA转染组，每个实验均重复三次，转染具体步骤按Lip

7、ofectamine3000试剂说明书进行。CBLL1表达质粒pcDNA3.1-HA-CBLL1由YasuyukiFujita教授惠赠。具体转染步骤按脂质体Lipofectamine3000试剂说明书进行，以转染空载体细胞作为对照。5.RealtimeRT-PCR用RNAIsoPlus提取细胞的总RNA后，进行逆转录实验，在ABI7900仪器上进行PCR反应。6.Westernblot10%SDS-聚丙烯酰胺琼脂糖凝胶电泳，浓缩胶电压80伏特，分离胶电压120福特。恒压50伏转印120分钟。转膜结束后，进行封闭，一抗4℃孵育过

8、夜，TTBS洗膜3次，每次10分钟，二抗室温孵育2小时，TTBS洗膜3次，每次10分钟。最后ECL发光。7.免疫荧光染色细胞爬片以后，4％多聚甲醛室温固定20min，PBS漂洗3次。染色步骤如下：5％BSA封闭2个小时，滴加一抗4℃孵育过夜，滴加FITC或TRITC标记山羊抗