山奈酚抑制金黄色葡萄球菌生物被膜形成的分子机制研究

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1、７分类号．单位代码：１０１８３：Ｓ８５９研究生学号：２０１５８８２００９密级：公开吉林大学硕士学位论文（学术学位）山奈酚抑制金黄色葡萄球菌生物被膜形成的分子机制研究ＭｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｉｎｈｉｂｉｔｏｒｅｆｆｅｃｔｏｆｋａｅｍｆｅｒｏｌｏｎｙｐＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓｂｉｏｆｉｌｍｆｏｒｍａｔｉｏｎ作者姓名：明迪专业：生物化学与分子生物学研究方向：生物制药．指导教师：王大成教授培养单位：动物科学学院２０１８年６月山奈酚抑制金黄色葡萄球菌生物被膜形成的分子机制研究Molecul

2、armechanismofinhibitoryeffectofkaempferolonStaphylococcusaureusbiofilmformation作者姓名：明迪专业名称：生物化学与分子生物学指导教师：王大成教授学位类别：理学硕士答辩日期：2018年6月4日未经本论文作者的书面授权，依法收存和保管本论文书面版本、电子版本的任何单位和个人，均不得对本论文的全部或部分内容进行任何形式的复制、修改、发行、出租、改编等有碍作者著作权的商业性使用（但纯学术性使用不在此限）。否则，应承担侵权的法律责任。吉林大学硕士学位论文原创性声明，本人郑重声明：所呈交学位论文是

3、本人在指导教师的指导下，独立进行研宄工作所取得的成果。除文中己经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果＝对本文的研宂做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明＾本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。Ｍ１３１学位论文作者签名：＾曰期：年月》曰＜中文摘要山奈酚抑制金黄色葡萄球菌生物被膜形成的分子机制研究金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus，以下简称金葡菌）是一种常见的革兰氏阳性致病菌，能够产生多种毒力因子从而引起人和动物的多种疾病。另外，金葡菌能在一些留置设备表面上形成生物被膜，使其可以承

4、受各种不利环境的影响，包括抗生素、营养限制、冷热以及免疫反应等。因此，这种形成生物被膜的能力被认为是金葡菌重要的毒力特征之一。此外，生物被膜的耐药机制也是抗生素不能作为治疗金葡菌感染的有效方法的原因之一。因此，目前急需寻找新的治疗方法来解决金葡菌感染引发的一系列难题。本研究的目的是筛选特异性抑制金葡菌生物被膜形成的抑制剂，并进一步探索其抑制作用机制，为将来抗金葡菌生物被膜药物的研发奠定基础。本实验通过在96孔板中包被冻干兔血浆模拟生物组织表面，使用金葡菌标准菌株ATCC29213建立体外生物被膜模型。从本实验室保存的多种天然小分子化合物中进行初步筛选，结果发现山奈酚具有明显的抗生物被膜

5、活性。进一步通过倍比稀释法检测不同浓度的山奈酚对生物被膜的影响，结果显示，山奈酚在较低浓度下显著的抑制生物被膜的形成，在64μg/ml时可以抑制约80%的生物被膜。此外，在荧光显微镜下观察到山奈酚对生物被膜的抑制作用呈剂量依赖性。MIC实验结果显示，山奈酚的最小抑菌浓度（MIC）＞1024μg/ml；24h细菌生长曲线分析结果显示，64μg/ml，128μg/ml，256μg/ml的山奈酚不影响细菌的生长，由此可见，山奈酚特异性的抑制金葡菌生物被膜的形成，同时并不影响细菌的生长。在金葡菌生物被膜形成的不同阶段加入山奈酚，结果发现山奈酚特异性的作用于生物被膜的粘附阶段。纤维蛋白原结合实验

6、进一步验证了山奈酚通过降低金葡菌的粘附能力从而抑制其生物被膜的形成。为进一步探索山奈酚抑制粘附的机制，通过荧光共振能量转移（FRET）的方法在体外检测山奈酚对金葡菌分选酶A（SrtA）活性的影响，结果发现64μg/ml的山奈酚对SrtA的活性抑制I47%。另外，通过金葡菌表面蛋白A（SpA）展示实验，结果进一步证实山奈酚在64μg/ml时没有完全抑制SrtA的活性。根据以上结果，推测山奈酚还可能存在其他机制抑制粘附。通过透射电子显微镜和激光共聚焦显微镜观察，结果发现山奈酚处理会导致金葡菌表面蛋白大量减少；荧光定量PCR的结果进一步显示，山奈酚下调了粘附相关基因的转录水平。以上实验结果表

7、明：山奈酚通过两种途径抑制金葡菌生物被膜的粘附阶段，一是通过部分抑制SrtA的活性从而减少粘附相关蛋白的锚定；二是通过下调粘附相关基因的转录水平从而减少粘附相关蛋白的表达。综上所述，山奈酚是一种具有全新机制的金葡菌生物被膜抑制剂，为抗生物被膜药物的研发提供了先导结构。关键词：金黄色葡萄球菌，生物被膜，粘附，山奈酚IIAbstractMolecularmechanismofinhibitoryeffectofkaempferolonStaphyl