两种纳米抗体在不同表达系统中表达的比较研究

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1、分类号：R915单位代码：10183研究生学号：2015772043密级：公开吉林大学硕士学位论文两种纳米抗体在不同表达系统中表达的比较研究ComparativestudyontheexpressionoftwoNanobodiesindifferentexpressionsystems作者姓名：孙维汉专业：生物药学研究方向：蛋白质基因工程药物研究指导教师：孙非教授培养单位：吉林大学药学院2018年6月两种纳米抗体在不同表达系统中表达的比较研究ComparativestudyontheexpressionoftwoNanobodiesi

2、ndifferentexpressionsystems作者姓名：孙维汉专业名称：生物药学指导教师：孙非教授学位类别：医学硕士答辩日期：2018年5月31日中文摘要纳米抗体在两种不同表达系统中的比较研究纳米抗体（nanobody）是一种新型的小分子抗体片段，由驼类天然的重链抗体重链可变区（variabledomainofheavychainofheavychainantibodies,VHH）克隆获得。分子量是完整抗体的十分之一，具有优良的生物学特性，拥有完整的抗原结合位点、耐恶劣条件（如低pH，高温）和低免疫原性、很好的组织穿透性，特异

3、性高，水溶性好。工程化单克隆抗体片段由于其多功能性和潜力而受到市场关注，被认为是未来免疫诊断和治疗的药物重要组成部分并具备较为广阔的发展前景。相同纳米抗体在不同表达系统中的表达方法以及表达质量，目前并没有得到系统深入的研究。本论文选取7D12和9G8两种纳米抗体，在大肠杆菌和毕赤酵母两种表达系统中分别表达进而比较差异，通过这种比较，为纳米抗体的工业化大规模生产奠定了基础。研究的具体内容如下：本论文利用基因工程方法，分别构建适合大肠杆菌系统表达的PET28a-7D12/PET28a-9G8重组质粒以及适合毕赤酵母表达系统的pGAPZaA-

4、7D12/pGAPZaA-9G8重组质粒，为后续表达蛋白提供基础。本论文首先对纳米抗体7D12进行表达，利用不同方法在大肠杆菌BL21和毕赤酵母X33中分别表达。在实验小规模成功表达的基础上，通过与本课题组其他研究人员合作，在中试规模上进行了7D12的发酵生产及分离纯化，获得到纯度不同的7D12样品，进行比较分析。在毕赤酵母中表达得到的样品量明显高于在大肠杆菌中表达量。之后对纳米抗体9G8在大肠杆菌BL21和毕赤酵母X33中分别表达。同样在毕赤酵母中表达得到的样品量较高于而在大肠杆菌中几乎没有表达。综上所述，两种纳米抗体在毕赤酵母X33

5、中均具有较高的表达量，且实验步骤更加简便，适合大量生产。基因工程药物表达系统的更新换代已势在必行，新一代毕赤酵母表达系统相关技术的发展将极大的推动整个生物医药产业的发展，有必要进行重点攻关。结合实验室硬件基础和实验基础，优化纳米抗体在毕III赤酵母表达系统中表达的条件，进一步提高纳米抗体的表达量。为之后连接药物治疗相关疾病奠定基础。关键词：纳米抗体，7D12，9G8，大肠杆菌表达系统，毕赤酵母表达系统。IVAbstractComparativestudyontheexpressionofNanobodiesintwodifferente

6、xpressionsystemsNanobodyisanewsmallantibodyfragment.ItisclonedfromtheVHH(variabledomainofheavychainofheavychainantibodies).Thesenature-madenanobodiesarewellsuitedforvariousapplicationsduetotheirfavorablecharacteristicssuchassmallsize,easeofgeneticmanipulation,completeant

7、igenbindingsite,goodtissuepenetration,highspecificity,highaffinityandsolubility,overallstability,resistancetoharshconditions(e.g.,lowpH,hightemperature),andlowimmunogenicity.Engineeredmonoclonalantibodyfragmentshavegainedmarketattentionduetotheirversatilityandtailor-made

8、potentialandarenowconsideredtobeanimportantpartoffutureimmunobiotherapeutics,andithasvastdevelopprospec