bvdv纳米抗体的筛选、表达及抗病毒效果的研究

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1、批分类号：密级：学号：2012103053单位代码：10759石河子大学硕士学位论文BVDV纳米抗体的筛选、表达及抗病毒效果的研究学位申请人张国奇陈创夫教授指导教师盛金良副教授申请学位类别理学硕士专业名称生物化学与分子生物学研究领域功能基因组与分子免疫学所在学院生命科学学院中国·新疆·石河子2015年6月Studyofscreening,expressionandantiviraleffectofNanobodiestoBVDVADissertationSubmittedtoShiheziUniver

2、sityInPartialFμLfillmentoftheRequirementsFortheDegreeofMasterofNatureScienceByZhangGuoqi(BiochemistryandMolecμLarBiology)DissertationSupervisor:Prof.ChenChuangfuShengJinliangJune,2015课题来源课题名称:国际合作项目（牛病毒性腹泻/粘膜病防治新技术）课题编号:2013DFR309I中文摘要牛病毒性腹泻病毒(Bovinevir

3、aldiarrheavirus,BVDV)主要引起牛病毒性腹泻-粘膜病(BVD-MD)，该病尚无完全有效的防制措施，对养牛业造成巨大的损失。骆驼体内发现存在一种天然缺失轻链的重链抗体，仅由其可变区组成的抗体称为单域抗体，又称为纳米抗体。纳米抗体具有高亲和力、高稳定性、强组织穿透性、高效表达等优点。构建抗BVDV纳米抗体基因文库，利用噬菌体展示技术获得高表达、特异性强的纳米抗体，为防治BVDV奠定基础。本文的主要研究内容如下：1、BVDV纳米抗体基因文库的库容量和多样性鉴定。本实验采用稀释计算法测定已构

4、建的文库库容量，随机挑取24个单菌落进行菌液PCR对抗体文库的重组率鉴定，阳性单克隆测序；利用MEGA4.0构建系统进化树、DNAMAN分析氨基酸序列同源性，6评价基因文库的多样性。结果表明基因文库库容达到1.22×10、重组率约83.3%、氨基酸序列同源性为63.51%，说明文库在保存过程中其库容量没有受到环境的影响，多样性丰富。2、BVDV纳米抗体文库的筛选和克隆鉴定。利用M13K07辅助噬菌体对基因文库拯救得到噬菌体展示文库，测定其滴度。以BVDV全病毒作为目标抗原，将其结合于固相上，加入噬菌体

5、展示文库，经三轮“吸附-洗脱-扩增”亲和筛选后，随机挑取单克13隆进行ELISA检测。结果拯救的噬菌体展示文库滴度约1.2×10cfu/mL，三轮筛选使噬菌体文库中的特异性单克隆得到有效的富集，ELISA检测得到1株阳性克隆，命名为VHH-A6。3、BVDV纳米抗体的原核表达和功能验证。根据VHH-A6基因的测序序列，设计引物，采用PCR扩增技术克隆VHH-A6基因，构建pET-28a(+)-VHH-A6重组原核表达载体，经SDS-PAGE检测目的蛋白，Ni柱纯化得到高纯度的目的蛋白，在细胞水平验证V

6、HH-A6纳米抗体对BVDV复制的影响。结果表明:成功获得VHH-A6基因及其重组原核表达载体，得到高纯度的目的蛋白。利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)测定MDBK细胞内的病毒拷贝数，结果发现100μg/mL的VHH-A6纳米抗体对BVDV的复制有一定阻断效果。本研究通过对BVDV纳米抗体文库进行三轮亲和筛选，从中筛选获得与BVDV特异性结合的纳米抗体VHH-A6片段，对其进行原核表达并纯化，细胞水平验证VHH-A6对BVDV的复制有一定的阻断效果，为进一步探讨纳米抗体干扰病毒复制机理奠定基础。

7、关键词：BVDV；纳米抗体；筛选；原核表达；复制IAbstractBovineviraldiarrhea-mucosaldisease(BVD-MD)iscausedbyBovineviraldiarrheavirus(BVDV),adiseasewithoutcompletelyeffectivepreventionandcontrolmeasures,andleadingtothehugelossesofthecattleindustry.Previousstudiesdiscoveredthat

8、thereisaheavychainantibodylackedwiththelightchainincamel,onlyconstitutedwithitsvariableregions,namedNanobody.TheNanobodyhaveadvantagesofhighaffinity,strongstability,penetratingontissueandeffectiveexpression.Constructingtheanti-BV