实验方案-细胞表型检测

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1、细胞表型检测1材料与方法1.1实验材料1.1.1供试品名称:人胎盘间充质干细胞、猴胎盘间充质干细胞的P4、P6、P8细胞1.1.2主要试剂自配天津昂赛细胞基因工程有限公司新西兰胎牛血清（特级）上海依科赛生物制品有限公司1.1.3自配天津昂赛细胞基因工程有限公司IgG-FITCBD公司货号:555748CD19-F1TCBD公司货号:555412CD34-FITCBD公司货号:555821CD44-FITCBD公司货号■■CD31-FTTCBD公司货号■■IgG-PEBD公司货号：555749CDllb-PEBD公司货号:555483CD45-PEBD公司货号：

2、555388CD73-PEBD公司货号:550257CD90-PEBD公司货号：555596CD105-PESerotec公司货号：MCA1557PEHLA-DR-PEBD公司货号:555812CD29-PEBD公司货号：血清主要仪器C02培养箱离心机超净工作台显微镜1.1.4主要耗材50ml离心管、5ml/10ml移液管、1・5mlEP管。1.1.5实验设计依据通过传代培养，我们可以得到相对纯的间充质干细胞，参考国际细胞治疗协会提出的间充质干细胞表型方面的标准,CD73、CD90和CD105阳性率不低于95%；CD45、CD34、CDllb、CD19和HLA

3、-DR阳性率不高于2%[1]。检测在传代过程中的细胞的表型是否会发生变化。我们设计检测P4代、P6和P8代细胞表型。1.2实验方法1.2.1细胞消化1、将原培养液倒净，用移液管取D液10沁冲洗细胞，倒净,此操作重复洗2次；2、用移液管吸取加入B液2ml,盖上培养瓶盖子,摇晃使B液均匀覆盖瓶底,待细胞从培养壁脱落下来；3、用移液管吸取加入C液0.5ml,终止消化，再加D液10ml,吹打细胞制成细胞悬液，将细胞悬液收集至离心管中；1.2.2流式检测方法1、收集细胞,lOOOrpm离心5min,用D液洗一次，过滤;2、用适量D液将细胞重悬，100u1每管分装到1.5

4、mlEP管中，每管细胞不少于用1X105,在每管中加入4u1要检测表型的抗体,室温避光放置30min；加入lmlD液混匀，离心弃上清，再用lmlD液混匀，离心弃上清，每管加入350-500u1D液重悬,移入流式管待测即可;3、用流式细胞仪检测荧光值，每管计数3000-10000个细胞；4、分析数据。1.3C6操作步骤(-)开机1、启动控制计算机，进入软件，此时信号灯为红灯，显示还没有与C6连接。2、检查四个液体容器，如有需要，则先充满液体或清空废液。3、启动C6前方的电源按钮，此时信号灯变为黄色，显示C6正在启动，等待3分钟左右直至信号灯变绿，显示C6已经连接

5、并就绪。4、在载物台上放置一个空管，点击控制Backflush按钮，可以看到少许液体流出来。5、在96孔样品格中任选一孔，载物台换上去离子水，选择高速，10分钟,点击RUN。（激光器预热）6、该孔因为收集了数据变成蓝色，点击DeleteSampleData删除。至此启动步骤已完成，可以开始检测样品。（二）检测样品1、将样品依次置于载物台上。2、在96孔样品格中选择不同的位置，依次命名。3、设定检测停止的条件：（1）无限制，手动点击停止；（2）收集了多少个点停止；（3）收集了多少时间停止；（4）收集了多少体积液体停止。（2—4可复选，达到任一设定指标就会停止）。

6、4、设定进样速度：慢速，中速，快速或者自己设定。5、设定阈值（一般不变，FCS-H>80000）。6、点击RUN。注意事项：1、样品之间无需用去离子水冲洗，但是当你完成所有样品检测后，必须运行清洗程序（Instrument菜单下cleaningfluidcycle）。2、若发生堵塞（观察每秒钟细胞数），则运行Backflush,再用去离子水冲洗2mino3、切记每测完一个样品必须保存（在开始检测时会提示你保存）。（三）检测结果分析（四）关机1、在任意一个打开的文件下，在96孔样品格中任选一孔，载物台上放置洗液（0.1%次氯酸钠），选择高速，运行2分钟。2、在9

7、6孔样品格中任选一孔，载物台换上去离子水，选择高速，运行2分钟。3、将去离子水的检测管一直留在载物台上。4、按一下C6前方的电源按钮关闭C6,此吋信号灯为黄灯，显示C6正在关闭，关闭的过程大约需要10分钟左右。5、退出控制软件，不用保存之前清洗步骤所收集的数据。关闭电脑。注意：与BDFACSAria不同，C6的关机程序所作的一系列相关步骤都是自动的，不需要与控制计算机相连接操作，C6与电脑控制软件相对独立，所以后面两个步骤（关闭C6和退出控制软件）无关先后。细胞因子检测1材料与方法1.1实验材料1.1.1供试品名称：人胎盘间充质干细胞、猴胎盘间充质干细胞的P4

8、、P6、P8细胞培养上清1.1.2主要