分子克隆操作技术注意事项_生物学_自然科学_专业资料

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1、分子克隆操作技术注意事项一、引物设计1.设计模板：基因过表达的设计模板为mRNA（根据基因名称和样品种属从NCBI查询），启动子（转录调控区域）的设计模板为基因组DNA片段（根据基因名称和种属从UCSC查询，并在NCBI核实序列），DNA甲基化分析（CpG岛，根据基因名称和种屈从UCSC查询，并在NCBI核实序列）；2.设计软件：VectorNTI用于设计过表达引物，VectorNTI用于设计启动了（转录调控区域）克隆引物；Methprimer用于设计DNA甲基化分析引物（BSP,MSP）3.5,和3,端的酶切位点和保护性碱基所用的载体的多克隆位点（MCS）有，所克

2、隆的序列没有，可以同时做双酶切,我们的酶库有，价格便宜的，加了保护性碱基可以直接进行PCR产物酶切的（详情见《保护性碱基・doc》）；二、引物溶解1.引物的储液浓度为100UM,计算加入灭菌水的量；2.打开管盖前，必须先12000RPM离心2min,因为引物为粉末，容易飘出；3.加入灭菌水溶解前，应稍微打开管盖即可，以免粉末飘出；4.引物溶液应・20°C保存；5.引物使用的工作液浓度为10uM,需要多少稀释多少，剩余的应丢弃；三、PCR1.操作注意事项：操作前，应熟知所用PCR酶的说明书，并熟知说明书标示的注意事项（引物、模板和酶的建议用量，变性温度及时间，延仲速度

3、等），PCR是极为灵皱的技术，因此要决定避免交叉污染，注意冰上操作，这样可以提高扩增的特异性；2.理解掌握每步操作的原理和注意事项；3.PCR实验进行前，应考虑以下儿个问题：引物的使用量，引物的反应浓度一般为0.2-1UM；模板的用量，各种模板的建议用量参考PCR酶说明书，原则上第一次进行PCR反应时，采取中间值；4.PCR常见问题及对策问题原因对策没有任何条带（“白板”）PCR体系中成分是否有遗漏添加重新进行实验没冇目的条带，但冇引物二聚体反应效率过低，其屮原因可能是引物与模板的配比不合适，不是模板加得越多反应效率就越高，退火温度过高，导致引物与模板无法配对调整引

4、物与模板的配比，一般按照PCR酶的说明书的建议选择合适的引物和模板的添加量，降低退火温度冇目的条带，但产量低反应效率低，•其中原因可能是引物与模板的配比不合适，不是模板加得越多反应效率就越高，退火温度高，导致引物与模板结合配对不稳调整引物与模板的配比，一般按照PCR酶的说明书的建议选择合适的引物和模板的添加量，降低退火温度有冃的条带，但有其他杂带反丿'V特异性不高，其中原因可能是引物设计存在缺陷，退火温度较低提高退火温度，如杲目的带与杂带相距较远，产物产量可以满足下游实验需要，可不考虑重新设计引物四、长引物退火产生DNA双链一般通过PCR扩增所需的DNA双链，如杲D

5、NA双链胶短（150bp以内），这可以通过合成互补长引物，并在引物两侧预留酶切后的酶切位点，通过变性退火程序即可形成互补的DNA双链，一般在制备shRNA编码框，miRNA过表达或干扰编码框时，可以采取上述策略；五、全基因合成如果通过PCR技术无法获取口标DNA片段，我们一般委托DNA合成公司进行全基因合成，只需告知我们需要合成的序列，并在序列的两侧加上克隆所需的酶切位点，服务公司合成后将克隆至克隆载体中，我们收到重组克隆载体（我们口己需要进行酶切鉴定和测序鉴定），需要利用预留的酶切位点亚克隆至我们的廿标载体屮，然后进行酶切鉴定和测序鉴定；六、琼脂凝胶电泳1.作用：

6、PCR产物鉴定，？悔切产物鉴定，胶冋收纯化PCR或酶切产物；2•胶浓度：一般为1%,根据分析产物的大小选择合适的胶浓度；3.电压：电压高，泳动速度快，耗时短，但产热量大，容易烧胶，条带模糊，电压低，泳动速度慢，耗时长，但产热量小，条带清晰，应根据实际情况选择合适的电压；4.电泳缓冲液：加入电泳缓冲液的量高过胶面1厘米以上，如果进行胶冋收时,必须使用新的电泳缓冲液液，这是为了避免污染（电泳槽和胶椚也需清洗干净并用超纯水润洗）和捉高回收效率（旧电泳缓冲液的PH环境不利用DNA回收）；5.理解掌握每步操作的原理和注意事项；七、酶切1.DNA的用量：一般使用0.5-lug,

7、这样可以保证条带清晰，酶切充分；如杲酶切产物中冇目的条带小于250bp,使用考虑使用较多DNA进行酶切，否则目的条带不清晰；2•限制性内切酶的用量：根据酶的活性单位进行添加，一般lul酶含10个活性国际单位，可以在1小时内充分酶切lugDNA,—般酶的用量不能超过酶切体系的1/10体积，否则产生星活性（酶切不特异）；3.酶切体系：酶切总体系-•般为20-30U1,体系人，可以使抑制酶切的因索稀释,但做琼脂糖凝胶电泳吋需要配制较厚的胶，根据DNA的浓度和纯度选择合适的酶切体系；4.缓冲液：根据限制性内切酶厂家的要求选择合适的缓冲液（buffer）,进行双酶切时，查