资源描述：
《克隆实验细则_生物学_自然科学_专业资料》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、准备：1、瓶了、量筒、钥勺、天平、摇床等；2、50ml离心管、1.5mL的离心管，125uL的PCR管、各种枪头、培养皿；3、超净工作台、酒精灯、蜡带封口膜、铝箔。LB培养基：（1L）胰化蛋片腺：10g,Tryptone酵母提取物：5g,yeastextractNaCI：lOg放好药品（100mL的培养基,加入200uL的20mg/mL的X-Gal,50uL的50mg/mL的IPTG,50uL的lOOmg/mL的Amp以后，振荡均匀，高压蒸汽灭菌120°C（注意：髙压灭菌，瓶盖要松，用胶带黏住两端）,22mino在60°C时，转紧瓶盖,拿出置于实验台上。固体培养基：LB固体培养基1L,和液
2、体一样，1）1115g琼脂粉，一定要在温度下降到55°C之前加好抗牛素，并口倒板。LB固体培养基倒板：1、配制：1000mL培养基加入1.5g琼脂粉。2、抗生素的加入：高压灭菌锅后，待温度降到60°C,将培养基拿出置于超净T作台中，人概降到55°C（手可以触摸加入抗牛素，以免温度过高导致抗生素失效，并且充分摇匀。3、倒板：-•般10mL到1个板子。培养基倒入培养1UL后，打开盖子，在紫外灯下照10—15mino4、保存：用封口胶封边，并倒置用铝箔包裹放于4°C保存，一个月内使用。一般克隆实验：超净工作台开启紫外提前半个小时1、DNA目的片段：T-vector：0.5uL®DNA:4.5uL
3、③2、加入5uLSolution!②（离心）。（注意步骤1和2：在冰上操作，慢慢加入，因为不稳定）3、16°C反应lh左右，如果冃的片段太长，可以延长时间。（零下20°C保存）。4、10uL上述体系屮然示和50uL人肠杆菌感受态cell,冰上静置30min,不可剧烈振动。（同时开启水浴锅，将SOC液体培养基放置在37C烘箱中待用）5、42°C水浴lmin后，冰上静置lmino6、将55uL的上述混合液体加入到500uL的SOC液体培养基中，摇床摇菌，37°C,振荡培养基lh或者lh以上（180r）。溶液有清澈变成稍显浑浊。7、离心3000r,8min,丢弃上清，200uL-300uL混合液
4、轻轻吹打，打入到铺有薄层固态培养基的培养皿中,涂板，固态培养基中已经加有X-Gal,IPTG,Ampo37°C过夜培养,4°C保存。8、挑菌，用枪头挑出白色的菌落，直接连枪头一起打入加有抗生素的液体培养基，培养基置于lmL的离心管中，摇床培养4h,37°C,220r,（抗性LB避光保存）。溶液冇清澈变为稍显浑浊。此时可直接拿出去测序，亦可以直接取2uL用于PCR.分子克隆实验步骤：1、配制液体培养基（Amp+,无Amp）,固体培养基。2、配制好的培养基要分装在1.5mL的离心管中，-20°C保存。Amp：溶解lg的Amp与水中，定容至lOmL,得到到浓度为100mg/mL的溶液，分装在1.
5、5mL的离心管中,-20°C保存。，用的时候稀释2000倍,配成50ug/mL的工作用浓度。储存液的浓度为50mg/mL.IPTG:将5g溶于1L灭菌水配制50mg/mL水溶液，过滤灭菌后，按ImL分装，-20°C避光保存。工作浓度为50mg/mLoX-Gal：工作浓度20mg/mL,储存浓度20mg/mL,・20°C避光保存。转化实验：准备：DNA,Vector试剂盒（冰上操作）16°C水浴，42°C水浴。无抗培养基（50mLXn）Amp+培养基（50mLXn）板，solutionl5uL操作：1、DNA：4.5uL+Vector：0.5uL+solutionl：5uL对照：Contro
6、linsert：luL+Vector:0.5uL+dH20:3.5uL+solutionl：5uL2、16°C培养30mino3、加入lOOuLCell,冰上放置30mino4、42°C培养60s,冰上放KImino5、加入ImLLB无抗,37°C摇菌lh,180“6、8000r,离心8min,800uL丢弃,200uL吹打。7、涂板（抗）。8、挑菌,加入ImL抗性LB。IPTG:是一种B■半乳糖井酶的的活性诱导物质，当载体DNA以lacZ缺失，由于的细胞为宿主进行转化吋，如果在平板培养基中加入X-Gal和IPTG由于0■半乳糖昔晦法人a■互补性，可以根据师傅哦出现匚I色菌落（或噬菌斑）而
7、方便地挑选出基因重组体，此外还有lac等启动子的表达载体的表达诱导物使用。诱导的原理：E.coli的乳糖操纵了（元）含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖昔酶、透酶和乙酰基转移酚，此外还有一个操纵序列0、一个启动序列P及一个调节基因I。I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游述有一个分解（代谢）物基因激活蛋白（CAP）结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构
