Westernblot_生物学_自然科学_专业资料

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1、蛋白免疫印迹流程2016.09.25注意事项：1.蛋H印记实验的步骤及需要注意的细节繁多、耗时长，稍冇懈怠或疏漏都会导致实验结果的不佳或失败，因此要特别的认真仔细，心细如丝，并保持这一状态至最后，这也是恒心、韧劲、精力集中的良好训练。细节决定成败！2.蛋白印记实验的目的是获得充分分离的、充分转膜的、均匀干净的（sharp）目的蛋口条带，能充分反映实际蛋口水平并可进行后续统计学分析的显色成像结果。所冇的实验细节都是围绕这个中心目的进行的。3.试剂：试剂质量达标、称量准确；缓冲液PH值正确、保质。4.玻璃板装载：玻璃板及支架干净、无异物；装载严密（不漏胶、漏液）。5.制胶：胶板成分比

2、例准确、浓度适当、均匀、干净（无异物、无气泡）。6.样品准备：量取精确、变性充分、无沉淀。7.上样：无溢出、样本溶液均匀分布、胶板无裂隙。&电泳：低温；电流通畅（上层电泳缓冲液充分）；电压、电流相匹配。9.转膜：胶、膜标记准确；转膜单位之间无气泡；胶、膜、滤纸大小一致；低温；电压、电流相匹配。10.切膜：分了量准确；标记准确；湿润（不干燥）。11.封闭：脱脂奶粉溶解充分；孵育温度、时间适当。12.—抗、二抗：质量无疑问；浓度适当；孵育温度、吋间适当。13.洗膜：摇速、时间适当。14.显色：淋干；显色液充分接触、无流失。15.膜：以上操作要求PVDF膜完整无损伤，不碰触、刮擦、冲刷

3、样木蛋白面。一、分离胶和浓缩胶的制备1、装载玻璃板彻底擦净玻璃板和支架，仔细检查，确保无异物，将玻璃板固定在支架上。备注：①玻璃板内外面耍彻底用酒精擦干净，特别是内面，确保无杂质异物及脂质、手印等，如有上述异物杂质，就易岀现胶中冇斑点、蛋白条带扭曲、转膜效率下降、PVDF膜不干净等现象。②玻璃板之间之间要严密接触，无异物，如有异物（如有胶块干固在上面），则易造成上紧旋钮时，异物致使玻璃板碎裂，如没有碎裂,就会出现漏胶的现象，使胶凝固不均匀（蛋白条带扭曲），胶面下降，有效分离胶距缩短，蛋白条带分离不充分的现象。③玻璃板与装置之间要严密接触，无异物，如有异物（如有胶块干固在上而），则

4、易造成上紧旋钮时，异物致使玻璃板碎裂，如没冇碎裂，就会出现在电泳时漏电泳缓冲液的现象，使电泳效杲不佳，并需频频补充上层的屯泳缓冲液。④上紧螺扭吋，要4个旋钮均匀同吋逐渐上紧，如先上紧1个，再上紧其他的，易出现各点松紧不一、错位，导致漏胶或漏电泳缓冲液的现彖。2、配置分离胶：依照0的蛋白分子大小和所需胶板的数量，配制适当浓度和体积的分离胶。（详见表附1）备注：①按照试剂的排列顺序依次加入到小烧杯中，每加入一种试剂后需要即时充分混匀（小烧杯有利于充分混匀），再加入下一种试剂，要稳健，不要着急，在TEMED和AP加入而不会凝胶。②特别是，TEMED和10%AP要同吋加入，并迅速充分混匀

5、，防止局部凝固并大量消耗TEMED和10%AP,其他部分凝固慢或不凝胶的现象。③混匀后的分离胶要尽快加入到玻璃夹层屮，防止加入前凝同。④配胶过程中液体的量取要准确，如杲Marker的带宽与胶的浓度不匹配，则说明胶的浓度配制冇误，胶中的成分比也会随之改变，将影响蛋白条带的分离。随着胶浓度的升高，大分子量蛋白条带间距会变窄，聚在一起，而小分子量蛋口条带的间距会变宽，所以高浓度的胶适用于小分子蛋白的分离。相反，随着胶浓度的的降低，大分了量蛋口条带间距会变宽，而小分了量蛋口条带的间距会变窄，聚在i起，所以低浓度的胶适用于大分子蛋白的分离。因此，依据Marker的带宽的变化，可以判断自己配

6、制的胶浓度是否正确（若上面条带宽，下面条带窄，则说明胶的实休浓度小于所需配制浓度;若上面条带窄，下面条带宽，则说明胶的实际浓度高于所需配制浓度）3、灌注分离胶及封胶：（1）立即将配制好的分离胶用移液枪灌注于安装好的玻璃板夹层内，至胶的液而距内侧短玻璃板上沿的1・5・2cm处时停止。备注：①灌胶时，开始可以快一些，胶面快到所需高度时，要放慢速度，防止加过量。②灌胶吋，将移液管贴靠在长玻璃板的内壁上，使胶沿玻璃板流下，以避免胶中产生气泡，气泡将使蛋口条带扭曲，转膜效率下降。③胶而一定要与内侧短玻璃板上沿相距1.5-2cm,宁长勿短，过短会导致浓缩胶胶距减少，蛋口样本不能被有效的浓缩。

7、（2）上层注满干净的蒸憾水封胶，等待胶聚合凝固。备注：①加水封胶的口的是压平分离胶面，如没有压平，胶面会坑洼不齐，造成蛋口条带的参差不齐。另外，水封还可防止胶和空气接触氧化。②加水封胶时，耍轻慢，并沿长玻璃板的内壁往复移动加注，使水均匀分布在分离胶上。如仅在一点快速灌注，易使胶浓度及形状发生改变，影响胶的均一性和蛋白条带的水平性，因分离胶本身也是含有大量水的，加水过快和不均匀，会稀释上层的分离胶并造成胶的浓度不均。③夏天胶凝固的时间约30min,夏天室温较高，凝固较快，冬天室温较