ellman测巯基

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1、Ellman'sReagent,埃尔曼的试剂，5,5'二硫代双-（二硝基苯甲酸），5克MolecularWeight:396.35分子量：396.35CAS#:69-78-3CAS号：69-78-3使用半胱氨酸标准精确量化巯基程序材料的制备·1反应缓冲液：0.1M的磷酸钠，pH8.0，含有1mM的EDTA2半胱氨酸标准品，分子量136.2：配成一定浓度梯度3Ellman试剂溶液：1mL反应缓冲液4毫克溶解DTNB程序1用反应缓冲液1.11配制一定浓度的半胱氨酸工作液StandardVolumeofReactionBufferAmountofCysteine(M.W.

2、=136.2)FinalConcentrationA100ml20.43mg1.5mMB5ml25mlofStandardA1.25mMC10ml20mlofStandardA1.0mMD15ml15mlofStandardA0.75mME20ml10mlofStandardA0.5mMF25ml5mlofStandardA0.25mMG30ml0ml0.0mM(Blank)2取若干试管，每管含50μLEllman试剂和2.5mL的反应缓冲液。3在各试管中加入250μL各浓度的标准工作液或待测物溶液注：对于未知的样品需要稀释，以便使其浓度在标准曲线的工作范围之内（理

3、想的浓度为0.1-1.0）。4在室温混合和反应15分钟。5在412nm处测量吸光度。6.根据得到数值生成一个标准曲线，测定待测样品由标准曲线计算SH含量摩尔吸光系数的程序精确量化的巯基的材料的制备1反应缓冲液：0.1M的磷酸钠，pH8.0，含有1mM的EDTA2Ellman试剂溶液：1mL反应缓冲液4毫克溶解DTNBB.测量吸光度1.去若干试管，每管加入50μL的Ellman试剂溶液和2.5mL反应缓冲液。2.加入250μL待测样品,，空白添加250μL反应缓冲液Note:尽量使待测样品的浓度小于1.0mM，浓度太高将会导致误差变大3.在室温混合和反应15分钟。4.

4、分光光度计412nm测定吸光度。5.根据TNB的摩尔消光系数(14,150)计算巯基含量TheTNBdianionhasarelativelyintenseabsorbanceat412nmcomparedto该国能在412nm的合成，有一个相对比较激烈的吸光度bothdisulfides.同时二硫化物。BecausethestoichiometryofproteinthioltoTNBformed由于蛋白质的巯基，以国能形成化学计量is1:1,TNBformationcanbeusedtoassessthenumberofthiolspresent.为1:1，国能

5、形成可以用来评估硫醇数目。Intheabsenceofdenaturants,onlyaccessiblethiolswillreact,whereas在变性剂的情况下，唯一能够找到的硫醇的反应，而inthepresenceofchaotropicagentsthetotalnumberofreducedCysresidues残留的chaotropic代理人在场的总数减少胱氨酸presentcanbemeasured.目前可以衡量的。Reductionoftheproteinfollowedbytreatment经处理后减少的蛋白质withchaotropesand

6、DTNBcanyieldthetotalnumberofcysteines(Cys-SH与chaotropes及DTNB能够产生的半胱氨酸总数（半胱氨酸巯基plusCys-SS-Cys).加半胱氨酸-β-半胱氨酸）。----ThereactionissensitivetoalkalinepH(OH)competeswithRS),反应是敏感的碱性pH值（俄亥俄州）与RS竞争），acidicpH(disulfidescanbebroken),oxygen(reoxidationofR-SH),and酸性pH值（二硫化物可以打破），氧（R的巯基再氧化），以及temper

7、ature(thermochromism).温度（热致变色）。Consequently,thereactionisusually因此，通常的反应是carriedoutwithanexcessofDTNBtoprotein,atneutralpH,fixedtemp-进行了过多的DTNB的蛋白质，在中性pH值固定的温度，erature,andsometimesunderanaerobicconditions.erature，有时在厌氧条件。Furthermore,TNBis此外，国能是sensitivetovariousbufferions,sotheextinc