Ellman方法说明书

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1、Ellman试剂介绍、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、1页半胱氨酸作为巯基基团的标准品、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、2页巯基基团的摩尔吸光度、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、2页故障排除、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、3页相关的赛默飞世尔科技产品、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、3页附加信息、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、4页参考文献、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、

2、、、、、、、、、、、、、4页半胱氨酸作为巯基基团的标准品A.原料制备·反应缓冲液：0.1M磷酸钠缓冲液，PH=8.0，包含1mMEDTA·半胱氨酸一水合盐酸盐，分子量175.6·Ellman试剂溶液：1mL反应缓冲液溶解4mgDTNBB.步骤1、在缓冲液中溶解一系列不同浓度的半胱氨酸：标准品缓冲液体积半胱氨酸质量最终浓度A100ml26.34mg1.5mMB5ml25ml标准品A1.25mMC10ml20ml标准品A1.0mMD15ml15ml标准品A0.75mME20ml10ml标准品A0.5mMF25ml5ml

3、标准品A0.25mMG30ml0ml0.0mM2、取若干试管，每个试管中包含50μL的Ellman试剂液和2.5ml的缓冲液。3、在各试管中加入250μL各浓度的标准工作液或待测物溶液。注：对于未知的样品需要稀释，以便使其浓度标准曲线的工作范围之内（理想的浓度为0.1-1.0）。4、室温下反应15min。5、测试412nm紫外吸收。4、根据得到数值生成一个标准曲线，测定待测样品由标准曲线计算SH含量基于摩尔吸光系数精确测量巯基的基团A.原料制备·反应缓冲液：0.1M磷酸钠缓冲液，PH=8.0，包含1mMEDTA·E

4、llman试剂溶液：1mL反应缓冲液溶解4mgDTNBB.吸光度测试1、对于每一个未知样本进行测试,准备一个包含50μL的Ellman试剂液和2.5ml的缓冲液。2、加入250μL待测样品,空白添加250μL反应缓冲液。3、室温下反应15min。4、测试412nm紫外吸收。5、根据TNB的摩尔消光系数(14,150M-1cm-1)计算巯基含量。自由巯基浓度的计算示例250μL整数倍的待测液与2.5ml缓冲液、50μL的Ellman试剂混合测试吸光度为0.879（减去空白），用1cm比色管。计算未知的巯基浓度mol/

5、L。报道的摩尔吸光数（摩尔消光系数，用M-1cm-1来表示），TNB在412nm这种缓冲条件下是14150。摩尔吸光系数E被如下定义：，A为吸光度，b为路径长度多少厘米，c为浓度mol/L。如上得：吸光度A=0.879，b=1cm，E=14150M-1cm-1，c=6.21×10-5mol/L。这个值代表试管中溶液的浓度，计算未知样品的浓度，有必要考虑稀释因素如下：被测溶液的总体积：如果测定溶液浓度为6.21×10-5mol/L，2.80ml溶液包含：这1.74×10-7mol来源于巯基测定溶液中由原来的0.25毫

6、升样品。因此，自由巯基在原始的未知样品的浓度为：可能遇到的问题可能原因溶液测试的巯基含量低于预期被氧化保持1-5mMEDTA螯合二价金属离子,金属离子可以氧化巯基