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《质粒提取原理剖析SDS酚氯仿NaOH核酸提取中的应用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、碱法质粒提取原理剖析-及SDS、酚、氯仿、NaOH的性质与在核酸提取中的应用1、提取液溶液l,50mM葡萄糖/25mMTris-CI/10mMEDTA,pH8.0；溶液II,0.2NNaOH/1%SDS；溶液山，3M醋酸钾/2M醋酸。2、提取液在作用剖析(1)让我们先来看看溶液I的作用。任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH,因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-CI溶液，是再自然不过的了。那么50mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的人肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶
2、液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没冇任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。那么EDTA呢？人家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂,配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达10mM的EDTA,无非就是耍把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA,其实也没什么大不了的，只要不磨洋工,只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTAo如果哪犬你手上止好缺了溶液I,可不
3、可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就叮以了。有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能冇结块。(2)轮到溶液II了这是用新鲜的0.4N的NaOH和2%的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH,无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2Ku减弱了碱件。很多人不知道具实破细胞的主要是碱，I佃不是SDS,所以才叫碱法抽提。事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会儿乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层
4、膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的0.4NNaOH,即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以口己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已。很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有止确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS呢？那是为下一•步操作做的铺垫。这•步要记住两点：第•,吋间不能过长，千万不要这时候去接电话，
5、因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；笫二，必须温柔混合（彖对待女孩子一样），不然基因组DNA也会断裂。基因组DNA的断裂会带来麻烦，后面我再详细说明。（3）每个人都知道，溶液III加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白这沉淀的本质最容易产生的误解是，当SDS碰到酸性后发生的沉淀。如果你这样怀疑，往1%的SDS溶液屮加如2M的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。大量沉淀的出现，显然与SDS的加入有关系。如果在溶液II中不加SDS会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀岀来的蛋口质。
6、既然SDS不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在1%的SDS溶液中慢慢加入5N的NaCI,你会发现SDS在高盐浓度卜是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCIrfu是KCI,你会发现沉淀的量要多的多。这其实是十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate）遇到钾离了后变成了十二烷基硫酸钾（potassiumdodecylsulfate,PDS）,而PDS是水不溶的,因此发生了沉淀。如此看来,溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS屮的纳离子形成了不溶性的PD
7、S,而高浓度的盐，使得沉淀更完全。大家知道SDS专门喜欢和蛋口质结合,平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋口质沉淀了。让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。这个过程不难想象，因为基因组DNA太长了，长长的DNA口然容易被PDS给共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。那么2M的醋酸又是为什么而加的呢？是为了屮和NaOH,因为长时间的碱性条件会打断DNA,所以要中和基因组DNA-旦发生断裂，只要是50-100kb大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了。所以
8、碱
9、处理的吋间要短，血冃不得激烈振荡
10、,不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。很多人误认为是溶液III加入后基因组DNA无法快速复性就被沉淀了，这是天大的误会,因为变性的也好复性的也好,DNA分子在屮性溶液屮都是溶解的。NaOH木来是为了溶解细胞而用的，DNA分了的
