waters e2695高效液相色谱

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1、主讲人：马贵红日期：2010-07-17高效液相色谱仪操作方法Waterse2695型什么是高效液相色谱法HighPerformanceLiquidChromatography高效液相色谱法，简称：HPLC是一种基于仪器方法的高效能分离手段：高性能的色谱柱，高精度、耐高压的输液泵以及高灵敏度的检测器……广泛应用于各个领域：医药/环保/石化/生命科学/食品及农业……在技术，理论及应用上仍处于发展阶段定量分析主要基于与标准品的比较是其最大应用领域定性分析；不是色谱的强项基于样品的保留时间比较借助于和其联用的紫外、质谱或其他检测器对定量及定性分析的要求灵敏度、精度及准确

2、度的要求样品量的要求；复杂样品的分析能力容易使用什么是高效液相色谱法高效液相色谱如何工作一个储液瓶装有溶剂[称为流动相，因为溶剂是流动的]。一个高压泵[溶剂传输系统或称溶剂管理器]用来产生和计量流动相的流速，一般是毫升/分钟。一个进样器[样品管理器或自动进样器]可以将样品导入[注射]连续的流动相，并由流动相携带样品进入高效液相色谱柱。色谱柱装有能获得分离效果的填料。这种填料称为固定相因为它被柱硬件包围住。检测器用来查看化合物流出色谱柱时被分开的谱带[大多数化合物没有颜色，所以人眼观察不到]。流动相流出检测器可被送至废液瓶，或按需被收集。当流动相含有一个分开的化合物

3、谱带，高效液相色谱可以收集含有纯化的化合物的该洗脱组分，用于进一步分析。注意高压管路和附件用来连接泵、进样器、色谱柱和检测器单元，形成流动相、样品和化合物分离谱带的通路。检测器连接计算机数据站，高效液相色谱系统单元先记录电信号，再将电信号转换为色谱图，在显示屏上展现出来。定性和定量样品内溶物浓度。由于样品中化合物性质差异很大，几种类型的检测器被开发出来。如果一个化合物能吸收紫外光，可使用紫外吸收检测器。如果这个化合物发荧光，可使用荧光检测器。如果该化合物没有上述性质之一，可使用更广泛的检测器，如蒸发光散射检测器[ELSD]。最强大的方式是顺序使用多个检测器。例如，

4、紫外和/或蒸发光检测器可和质谱仪[MS]联用来分析色谱分离的组分。这样，从一次进样，可得到分析物的更多综合的信息。将质谱与高效液相色谱系统耦合称之为液质联用.高效液相色谱如何工作液相色谱的基本流程图流动相泵色谱柱检测器泵输液分离检测记录AEGBCDF进样阀进样液相色谱的各部分示意图液相色谱实验所需的基本参数--亦称色谱条件流动相：种类及配比，等度或梯度固定相：色谱柱类型及内径、长短流动相输送系统参数：流速检测器参数：紫外检测波长，灵敏度等温度控制进样量仪器组成及开机溶剂管理系统的准备样品管理系统的准备运行样品数据采集报告打印关机Waterse2695型高效液相色谱

5、仪操作方法Waterse2695型高效液相色谱仪操作方法仪器组成及开机1仪器组成Waterse2695分离单元2498型紫外检测器色谱管理工作站打印机四元梯度洗脱的溶剂输送系统四通道在线真空脱气机可容纳120个样品瓶的自动进样系统柱温箱内置的柱塞杆密封垫清洗系统溶剂瓶托盘液晶显示器键盘用户界面及软盘驱动器2开机打开电源至on位置，开机依次接通2695分离单元、检测器、计算机和打印机的电源。接通后，约20s仪器开始自检，约1min后，显示主屏幕，此时继续各部件的初始化。溶剂管理系统的准备流动相脱气确认所有溶剂管路都充满溶剂，按【Menu/Status】，进入“Sta

6、tus（1）”屏幕溶剂管理系统的准备必须用色谱纯有机溶剂，水或缓冲盐要用超纯水；水相流动相需要每48h重新配制，特别是100%含水流动相；检查6根管子是否均在液面下，必须保证6根管子全部插到溶剂瓶底部。打开真空脱气机（degasser）Wetprime（执行湿灌注）流动相平衡色谱柱同理温度、流速都可在此控制面板设定！流动相特性（1）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；（2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。（3）若流动相的极性大于固定液的极性，

7、则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。常用溶剂的极性顺序：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六环>四氢呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>异丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>环己烷>己烷>煤油(最小)流动相方面要求除去微粒纯度的要求超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低（建议走空白检验）缓冲液的pH值，在填料的允许范围内缓冲液（盐）的浓度溶剂：色谱纯，并与填料相匹配溶剂中的杂质含量注意溶剂的相容性，避免使用不相容的溶剂流动相对样品的溶解度有机溶剂或水的比例流动相的转换要缓慢流速(压

8、力)的变化