超高分辨率显微镜简介

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1、超高分辨率显微镜简介阿贝衍射极限:光学显微镜分辨率提高绕不开的大山1873年，德国科学家阿贝提出了衍射极限理论：光是一种电磁波，由于存在衍射，一个被观测的点经过光学系统成像后，不可能得到理想的点，而是一个衍射像，每个物点就像一个弥散的斑，如果这两个点靠得很近，弥散斑就叠加在一起，我们看到的就是一团模糊的图像。2阿贝衍射极限:光学显微镜分辨率提高绕不开的大山3阿贝衍射极限:光学显微镜分辨率提高绕不开的大山4阿贝衍射极限:光学显微镜分辨率提高绕不开的大山阿贝提出，分辨率的极限近似于入射光波长的二分之一(d=λ/2)。可见光的波长通常在380~780

2、纳米之间，根据衍射极限公式，光学显微镜的分辨率极限就在200纳米（0.2微米）左右。如果物体小于0.2微米，你仍旧看到的是一个模糊的光斑。这就是很长一段时间内，光学显微镜的分辨极限。电镜是否绕过了阿贝定律，突破光学极限了呢？没有!电镜使用了更短的入射光波长。传统显微镜局限1.传统光学显微镜观察细胞内器官/病毒/寄生虫三维空间精确定位和分布蛋白质结构/定位/功能关系,蛋白质-蛋白质相互作用时空顺序活性因子调节细胞生命活动以上活动均在nm量级,而传统光学显微镜在水平200nm,Z轴500nm范畴2.电子显微镜能观察细胞内囊泡/线粒体定位,但缺乏特异

3、性探针,不适合定位单个蛋白质分子6,不能对活细胞观察超高分辨率成像技术Stimulatedemissiondepletion(STED)StructuredIlluminationMicroscopy(SIM)Single-MoleculeLocalizationMicroscopy–photoactivatedlocalizationmicroscopy(PALM)–stochasticopticalreconstructionmicroscopy(STORM)–fluorescentphotoactivationlocalizatio

4、nmicroscopy(FPALM)7一.STED8STED原理:910STED以光制光1蓝激光激发出绿光2用红激光产生受激发射（甜甜圈）3红绿两色同时产生，用滤光片过滤红色4获得小于200nm的绿色光斑1994年理论提出2008年商品化11实际样品成像测试图片由IBP季伟老师提供12二.SIMUniversityofCalifornia,MatsG.L.Gustafsson提出13SIM原理14SIM原理15SIM16三.单分子定位显微成像技术PALM/STORM基于全内反射荧光(TIRF)成像技术：有效减少背景信号及有利于单分子荧光信号

5、的采集TIRF=TotalInternalReflectionFluorescence17单分子质心确定—数学运算18TIRF全内反射荧光19TIRF/单分子定位·超分辨率奥林巴斯高端Xcellence系统TIRF原理:Snells’Lawn1n2n2o90θ介质面2EPIn1θθ1θ’1θ1=θ’1(反射)cSnells’Law光入射到不同介质的界面上会发生反射和折射当入射角为临界角时，光沿介质表面传播当入射角大于临界角时，发生全反射现象WFC.A.TIRFTIRF/单分子定位·超分辨率奥林巴斯高端Xcellence系

6、统TIRF原理:消逝波和渗透深度消逝波:z轴强度指数性衰减Z渗透深度50–300nmTIRF112TIRF/单分子定位·超分辨率奥林巴斯高端Xcellence系统利用消逝波可以对贴壁细胞50-300nm内的荧光标记物质进行荧光观察。分子扩散•信使/转运分子动力学•膜融合•细胞/细胞的相互作用•细胞骨架动力学囊泡运动、溶酶体、胞吞胞吐单分子检测为什么白天看不到星星?©OLYMPUSSOFTIMAGINGSOLUTIONSGMBH08/12/2014Page25TIRF/单分子定位·超分辨率奥林巴斯高端Xcellence系统TIRF示例一WFTIR

7、FTIRF/单分子定位·超分辨率奥林巴斯高端Xcellence系统TIRF示例一TIRF：微丝的生发宽场TIRF/单分子定位·超分辨率奥林巴斯高端Xcellence系统TIRF示例二：囊泡的释放TIRF示例三：细胞的运动Confocal：ActinRunTIRF：ActinRunTIRF/单分子定位·超分辨率奥林巴斯高端Xcellence系统TIRF示例四：模拟癌细胞沉降TIRF示例五：溶酶体酸性物质的释放TIRF/单分子定位·超分辨率奥林巴斯高端Xcellence系统TIRF技术，让我们以极高的信噪比对超薄Z轴空间（50nm）的荧光进行检测超

8、高的信噪比让我们可以检测到单分子检测到单分子，基于此，有了单分子定位超高分辨率技术A.STORM33STORM庄晓威2006年提出的方法基于高精度