提高仔猪大肠杆菌病三价灭活疫苗抗原单位的试验

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1、提高仔猪大肠杆菌病三价灭活疫苗抗原单位的试验尹尧，礼颖（哈药集团生物疫苗有限公司,黑龙江哈尔滨150069）［摘要］为了提高仔猪大肠杆菌病三价灭活疫苗抗原单位，在生产中进行了一些试验，对此进行分析、总结。［关键词］仔猪大肠杆菌；抗原单位仔猪大肠杆菌病病原为产肠毒素大肠杆菌，该菌致病力主要由粘附素性菌毛和肠毒素两类毒力因了构成，主要危害一周龄内的初仔猪。仔猪大肠杆菌病三价灭活疫苗分别带有K88、K99、987P纤毛抗原的大肠埃希氏菌，接种于适宜培养基培养，将培养物经甲醛溶液灭活后，加氢氧化铝胶制成。用于预防由大肠杆菌引起的新生仔猪腹泻病（即仔猪黄痢

2、）［2］o本品生产用三个菌种，半成品检验用三个菌种，菌种繁多，生产繁琐，工艺复杂，因此生产高质量的产品需要克服很多困难。1提高菌种的抗原性1.1菌种标准1.1.1形态和生化特性菌株应具有大肠埃希氏菌的典型形态和生化特性。为革兰氏阴性无芽抱的直杆菌，大小0.4-0.7uni><2-3uiii,两端钝圆，散在。本菌为需氧菌，在普通培养基上生长良好，最适生长温度为37°C,最适生长pH为7.2-7.4o1.1.2培养特性接种适宜改良Minca琼脂平板上，在36-37°C培养20小吋，菌落光滑圆整。在改良Minca汤中，36-37°C培养20小时，呈均匀

3、混浊，用相应的K88、K99、987P因子血清做平板凝集反应，应达到强阳性反应。1.1.3血清学特性用O抗原定型血清和K88、K99、987P因了血清对菌株进行血清型鉴定，均应符合菌株的抗原结构。C83549为0149：K88ac、C83644为068：K99、C83710为09：987P、C83902为08：K88ac>C83912为O■:K99、C83917为09：987P。1.2菌种的选择1.2.1一级菌种的选择用低倍镜选取光滑圆整单个菌落，然后做凝集试验，达到++++单个菌落，作为一级菌种。1.2.2二级菌种的选择一级菌种划斜面进行培养，

4、将斜面做凝集试验，达到++++的作为二级菌种备用。1.2.3三级菌种的选择将凝集达到++++的二级菌种接入用改良Minca汤中，振荡培养，培养结束做凝集试验，达到++++的作为三级菌种备用。2提高菌液培养的抗原性2.1培养温度的选择由于我们培养的需要的是纤毛，纤毛必须在37°C、需氧培养时才产生或表达，而18°C则不产生。因此培养温度我们控制在37°C,上下幅度不超过0・2°Co2.2搅拌转速的选择由于我们培养的需要的是纤毛，大肠杆菌极易生长，但是纤毛不易产生或表达，如果我们增加搅拌速度，纤毛产生或表达时同时在脱落，然后由新的纤毛产生或表达，提高

5、了菌液的抗原性。2.3原材料的选择在生产过程发现，同样的原材料不同的产地，有不同的凝集效果。例如：在C83902菌种的培养时候发现，用不同产地的琼脂，有产生自凝现象发生，作为一个检验用菌种，是严格要求不允许有自凝现象产生的。2.4通气量的选择大肠杆菌在培养初期市于细菌数量较少并且尚未适应培养环境，细菌几乎不增殖，因而耗氧量较少，通气量可以适当小一点。随着发酵时间的增加，发酵液中的细菌逐渐增多，代谢增强,耗氧量增加，需要加大通气量以提高溶氧量，满足细菌对氧气的需求。3通过以上方法的改进，我们生产几匹大肠杆菌病三价灭活疫苗原液，对改进前及改进后进行了

6、抗原单位比较：改进前改进后批号菌数（亿/ml）抗原单位（个抗原单位/ml）批号菌数（亿/ml）抗原单位（个抗原单位/ml）K99-2009-014044.0K99-2009-0464167.8K99-2009-024666.8K99-2009-0561402.6K99-2009-035055.0K99-2009-0672686.4K88-2009-015222.6K88-2009-044885.8K88-2009-025035.2K88-2009-05101141987P-2009-025322.6987P-2009-033468.84结语4.1

7、仔猪大肠杆菌病三价苗的抗原单位大幅度提高，但是就其中的987P、K88抗原单位与K99相比，还有很大的提高幅度空间。4.2仔猪大肠杆菌病三价灭活疫苗，在应用中发现有轻微的过敏反应，有的资料也介绍了此类反应，同时也进行了报道如何消除此反应,但是本人认为，如何提高抗原单位同时降低菌数，是最好的方法，省去了后续的生产步骤，而节约了生产成本，利于大量生产。参考文献[1]陆承平•兽医微工物学[M].北京：中国农业出版社，2001.4,215-223o[2]中华人民共和国农业部•中华人民共和国兽用生物制品规程二000年版[s]・[3]冯忠武•动物生物疫苗[M

8、].北京：化学工业出版社2007.8,218-221[4]俞俊棠，唐孝宣.生物工艺学[M].上海：华东理工大学出版社2003.1117-