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1、实验一淀粉酶活力测定一、目的淀粉是葡萄糖以a-1,4糖昔键及a-1,6糖昔键连结的高分子多糖，是人类和动物的重要食物，也是食品、发酵、酿造、医药、纺织工业的基木原料。淀粉酶是加水分解淀粉的酶的总称，淀粉酶对淀粉的分解作用是工业上利用淀粉的依据，也是生物体利用淀粉进行代谢的初级反应。小麦成熟期如遇阴雨天气有的品种会发生严重的穗发芽，造成巨大损失，这是小麦种子屮淀粉IW活动的结果。因此，淀粉酶活性测定，既有理论和应用研究的意义。通过本实验，学习酶活性测定的一般方法，巩固并熟练分光光度计的使用。二、原理淀粉酶主要包折「淀粉酶、B-淀粉酶、葡萄糖
2、淀粉酶和R-酶，它们广泛存在于动物、植物和微生物界。不同来源的淀粉酶，性质有所不同。植物屮最重要的淀粉酶是a-淀粉酶和B-淀粉酶。淀粉酶随机作用于直链淀粉和支链淀粉的直链部分aT,4糖昔键，单独使用时最终生成寡聚葡萄糖、a极限糊精和少量葡萄糖。C屮能使a-淀粉酶活化和稳定，它比较耐热但不耐酸，PH3.6以下可使其钝化。B-淀粉酶从非还原端作用于a-1,4糖昔键，遇到支链淀粉的a-1,6键时停止。单独作用时产物为麦芽糖和B-极限糊精。B-淀粉酶是一种疏基酶，不需及C「等辅助因了，最适pll偏酸，与a-淀粉酶相反，它不耐热但较耐酸，70°C保
3、温15min可使其饨化。通常提取液中a-淀粉酶和B-淀粉酶同时存在。可以先测定(a+B)淀粉酶总活力，然后在70°C加热15min,钝化淀粉酶，测出淀粉酶活力，用总活力减去淀粉酶活力，就口J求出B-淀粉酶活力。淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉生成的还原糖与3,5-二硝基水杨酸的显色反应来测定。述原糖作用于黄色的3,5-二硝基水杨酸生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，生成物颜色的深浅与还原糖的量成正比。以每克样品在一定时间内生成的还原糖(麦芽糖)量表示酶活大小。三、仪器.试剂和材料1•仪器(1)电子天平(2)研钵(每组1个，每班18个)(3
4、)容量瓶(100ml每组1个，每班18个)(4)具塞刻度试管(25ml每组8支，每班144支)(5)试管(15ml每组8支，每班144支)(6)吸量管lml,2ml,5ml(7)禺心机(8)离心管(9)恒温水浴(10)分光光度计试剂瓶：200ml每班9个；100ml每班6个2•试剂(为每班用量)(1)1%淀粉溶液(每组16ml,共288ml)(2)0.4mol/L氢氧化钠(每组32ml,共576ml)(1)pH5.6柠檬酸缓冲液(每组8ml,共144ml)称取柠檬酸20.Olg,溶解后定容至1000ml,为A液。称取柠檬酸钠29.41g,
5、溶解后定容至1000ml,为B液。取A液13.7ml与B液26.3ml混匀，即为pH5.6之缓冲液。(2)3,5-二硝基水杨酸(每组30ml,共540ml)精确称取lg3,5-二硝基水杨酸溶于20mllmol/L氢氧化钠中，加入50ml蒸1：留水，再加30g酒石酸钾钠,待溶解后用蒸傭水稀释至100ml,盖紧瓶塞，防止C0,进入。(3)麦芽糖标准液(lmg/ml)(4?组7ml,共126ml)称取0.100g麦芽糖，溶于少量蒸锚水，定容至lOOmE(6)石英砂3.材料萌发3天的小麦芽(每组2g,每班共36g)°四、操作步骤1・酶液提取称取2
6、g萌发3天的小麦种子(芽长1cm左右),置研钵中加少量石英砂和2ml左右蒸懈水，研成匀浆，无损地转入100ml容量瓶中，用蒸懈水定容至100mlo每隔数分钟振荡1次，捉取20mino3000r/min离心10min,转出上清液备用。2、淀粉酶活力测定(1)取试管4支，标明2支为对照管，2点为测定管。(2)于每管中各加酶液lml,在70°C±0.5°C恒温水浴中准确加热15min,钝化淀粉酶。取出后迅速用流水冷却。(3)在对照管中加入4ml0.4mol/L氢氧化钠。(4)在4支试管中各加入lmlpH5.6的柠檬酸缓冲液。(5)将4支试管置另
7、一个40°C±0.5°C恒温水浴屮保温15min,再向各管分别加入40°C下预热的1%淀粉溶液2ml,摇匀，立即放入40°C恒温水浴准确计时保温5mino取出后向测定管迅速加入4ml0.4mol/L氢氧化钠，终止酶活动,准备测糖。3.淀粉酶总活力测定取酶液5ml,用蒸憎水稀释至100ml,为稀释酶液。另取4支试管编号，2支为对照，2支为测定管。然后加入稀释之酶液1mlo在对照管中加入4ml0.4mol/L氢氧化钠。4支试管中齐加lmlpII5.6Z柠檬酸缓冲液。以下步骤重复a-淀粉酶测定第(5)步的操作，同样准备测糖。4.麦芽糖的测定(1
8、)标准曲线的制作取25ml刻度试管7支,编号。分别加入麦芽糖标准液(lmg/ml)0.0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.0ml,然后用吸管向各管加蒸憾水使溶液达2.0ml,再各加3,
