酶组织化学刘学光ppt课件

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1、酶组织化学刘学光复旦大学基础医学院病理学系glxg69@shmu.edu.cn酶是生物体内具有催化作用的特殊蛋白质一般催化剂的共性：1.用量少而催化效率高2.不改变化学反应的平衡点3.可降低反应的活化能作为生物催化剂的特性：1.催化效率高：比其他催化反应高107-1013倍2.高度专一性3.易失活4.酶活力受调节控制5.酶的催化活力与辅酶、辅基及金属离子有关酶的分类、命名1.习惯命名法：底物，所催化的反应性质，来源，其他特点2.国际系统命名法：酶的底物+催化反应的性质3.主要分类：催化反应的性质，六个大类（1）氧化还原酶:氧化还原反应（2）移

2、换酶：功能基团的转移反应（3）水解酶：水解反应（4）裂合酶：从底物上移去一个基团而形成双键，或其逆反应（5）异构酶：同分异构体的相互转变（6）合成酶：连接酶催化一切必须与ATP分解相偶联且由两种物质（双分子）合成一种物质的反应酶组织化学(EnzymeHistochemistry)通过细胞内固有的酶催化底物的作用，并借助显色反应，在切片或涂片上显示组织或细胞中内源性酶的活性及定位。特点（1）原位检测：组织定位（2）显示酶活性发展历史Klebs(1868)年&Struve(1872)证明中性多核白细胞过氧化酶存在1939年前，研究细胞内的氧化反应

3、1939年，Takamatsu、Gomori碱性磷酸酶（硫化钴反应、银反应）随后：磷酰胺酶、ATP酶、脂酶、酯酶等金属盐法，硫化钴法，偶氮色素法，偶氮色素四唑盐法，磷酸化酶组织化学证明法……电镜酶组织化学：酶更精准的定位1955年Scheldon、Brandes金属沉淀法1967年Seligman锇黑化法免疫组织化学：抗原抗体反应+酶反应1970年Sternberger酶标抗体法基础知识（一）细胞内的酶的特性*水溶性，易扩散，难溶或不溶于有机溶剂*有机溶剂不同程度降低酶的活性*易受温度影响，对热耐受性弱*对干燥耐受性强（二）酶的定位在细胞内或

4、超微结构中存在于特定部位浆膜—5’-核苷酸酶细胞膜—ATPase线粒体……1.酶促反应细胞内的酶催化分解合适的底物，生成中间产物，即：初反应物(primaryreactionproduct,PRP)。2.显色反应其中之一再与辅助物经一步或二步反应，生成有色不溶水的终反应物(finalreactionproduct,FRP)沉积在原位以显示酶的存在和活性大小。酶组织化学的基本原理Artifact—PRP弥散→定位不准确受3个因素影响：1.底物在酶催化下水解的速度—快2.PRP在缓冲液中的弥散系数—小3.PRP与辅助物反应的速度—快辅助物浓度一般

5、≦1mg/ml一般原则最大限度保存酶活性、防止弥散、保证反应产物的特异性1.标本处理及制片不能影响酶活性和分布2.底物对酶有特异性：酶抑制剂/激动剂检测特异性3.底物和辅助试剂渗透好：迅速，同步4.辅助试剂不能影响酶活性和其它反应剂的渗透5.PRP与辅助试剂反应要快FRP必需是水不溶、有色且稳定的物质6.所有试剂不能与组织细胞有非特异性的吸附主要步骤1.组织处理：不固定（冷冻切片，新鲜）固定（特殊固定剂，低温包埋）2.孵育3.显色4.显微镜下观察各步骤需要注意的问题：1.组织处理：“最大限度保存酶活性”最常用：新鲜组织，快速冷冻，冰冻切片长期

6、保存需密封，-70℃丙酮固定，低温脱水、包埋（eg.γ-谷氨酰转肽酶）常规方法（极少数酶类：氯乙酸酯酶）染色前的预固定—保持组织良好形态丙酮:氯仿=1:14oC，5~10分钟多聚甲醛，甲醛，戊二醛Note:含有抑制酶活性/细胞化学成分活性的重金属盐Hg/Cr/Pb等不用做固定剂固定方法：浸泡固定灌流固定细胞涂片、培养细胞:干燥、密封、低温2.切片制作:一般8－12μm3.缓冲液：用于配置固定液，漂洗液，酶反应孵育液配制酶反应孵育液（1）清洗器皿，过酸冲洗（2）现用现配，保持新鲜（3)严格配比，保持平和（4）防止污染过滤为佳（5）优选试剂，注意

7、纯度4.孵育反应a.温度及时间：37oC，15-30minb.孵育反应：切片孵育；漂浮孵育5.酶显示方法（1）同步显示法（2）二步显示法（孵育后偶联法）（3）底物自身显示法6.酶特异性对照实验用酶活性抑制剂激活剂采用无底物的孵育液过固定或加热改变孵育液选择PH值细胞内的定位差异对结果分析要考虑的问题经冷冻和原位固定后，酶究竟能保存多少?酶是否在原位?反应酶起了多少作用？酶的活性是否代表了细胞生活时的状态?沉淀的产物是否代表酶本身，时间延长是否会有改变，有没有扩散移位？常用酶显示方法（1）同步显示法：PRP+辅助物→有色FRP某些金属本身或化合

8、物生成颜色（eg.金属离子沉淀反应）硫化钴（黑色）硫化铅（棕黑色）（2）二步显示法（孵育后偶联法）酶与底物作用产生的PRP沉积于原位，随后行显色反应适用于：PH反应