猪冷冻精液技术研究

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1、猪冷冻精液技术研究夏天'高金銮'付光栋2姚德成'黄江春''陆肖芬'陈杰"周三华"力长华2（1.海南（罗牛山）养猪研究所海南海口571126；2.罗牛山畜牧公司海南海口571126；3.罗牛山人工授精站海南海口5711264.罗牛山新华猪场海南海口571126）摘要：通过反复试验，选择活力0・7级以上的新鲜公猪精液，过滤后立即用BTS液按1：1稀释在17°C冰箱中平衡2.5~3h后，用2000g/min,离心8min,去上清液后，用加海藻糖的TCG卵黄液按1：1稀释，后在0〜4°C冰箱中平衡2h,然后按体积加入甘油，甘油最终浓度为3%,再分装至0.5ml塑料细管中，置于0°C冻箱中平衡lh,在铝

2、盒中距液氮面3cm处冷冻，结果表明，经液氮储存的猪精液在52°C水温下解冻12s,解冻活力在0・3级以上，输精6头母猪，共产仔55头，平均9.16头，活健仔53头，平均8.82头。自1950年英国polge发明冷冻精液技术以来，首先在奶牛群中普及，随后在其它牛属动物中扩大推广，其后乂在羊属动物中推广。但在猪祥的推广较少见，猪的精液量很大（平均为170ml）且不易冷冻，儿十年来，虽有研究报导，但受胎率低、产仔数少，应用极不普遍。近年来国外种猪公司，虽有少量应用，但其价格昂贵不易推广应用，国内目前虽有多家院校进行研究，但至今无一家正式应用于生产。为了海南种猪事业的发展，和便于国家核心育种场交流种猪

3、血统以及地方优良猪种特别是濒危猪种的保护，我们从2008年开始历时5年，进行了猪冷冻精液技术的研究，现将研究情况报告如下。1试验地点与材料1.1试验时间2008年〜2010年4刀1.2试验地点中科院海口科学实验室、罗牛山猪人工授精站实验室、海南养猪研究所实验室、罗牛山新华猪场1.3试验材料液氮、干冰、无水酒精、-80°C低温冰箱、17°C恒温冰箱、普通冰箱、相差显微镜、显示器、空调。BTS稀释液（口配）、TCG+海藻糖稀释液（口配）、新鲜鸡蛋黄、LT油、0.25ml>0.5ml、2.5ml细管、秒表等。1.4试验方法正交试验法、以2〜3个评定员凭经验评定冻后活力，记录按评定的平均值计算，0.3

4、以上活力为合格。随机挑选母猪作输精试验。2试验内容与结果2.1探索另类冷冻技术先进行预备试验，探索另类冷源。我们利用中科院海口科学实验室的-80°C冰箱，将无水酒精预冷冻到-80°C,将处理好的精液装入饮料细管中，用聚乙烯醇粉封口，以及装入生化用的耐冻塑料细管中（直径10mm盖上盖子）浸入已预冷至于-80°C无水酒精中（酒精的冰点为-112°C）经7次试验见表1：试验次数冻后活力饮料细管塑料安瓶1〜7次0.000.00由于降温控制不好，精液密封不严，有酒精渗入，试管口径过大，7次试验冷冻后活力均为0.00级，但视野中仍有个别直线前进运动的精子。2.2三种冷源的比较为了比较另类冷源与止规冷源（干

5、冰、液氮）的优劣，我们仍用无水酒精。无水酒精是装入大口试管后在干冰中预冷到-78°C,所用细管为日本产正规0.25ml冷冻精液用细管，外面加一个料薄膜套。正交试验结果表2：试验号A：AGE配方中添加B：卄油浓度C：分装及冷源三人评均活力评分1海藻糖14%3洒精细管0.112氨基乙酸14%1干冰颗粒0.283海藻糖卵黄14%2液氮颗粒0.451海藻糖25.5%2液氮颗粒0.232氨基乙酸25.5%3洒精细管0.003海藻糖卵黄25.5%1干冰颗粒0.281海藻糖37.0%1干冰颗粒0.192氨基乙酸37.0%2液氮颗粒0.163海藻糖卵黃37.0%3洒精细管0.10A10.18B10.28C10

6、.25A20.15B20.17C20.28A30.28B30.15C30.07本次试验结果显示，冷冻液配方的海藻糖+卵黄液为好，三种廿油浓度以4%廿油的低浓度为好。冷源选择以酒精细管为并，加上在干冰中预冷的无水酒精不适合大量制作猪精液冷冻，故在后续试验中淘汰出局。2.3配方屮海藻糖剂量的优选在冷冻保护液中，加入海藻糖是近年新发现的一项研究成果，我们先后在TCG冷冻保存液中加入1.25%.1.65%两个剂量，取得了制造合格精液的目标，但也有失败的记录,后来又进行了加入3.5g/100mlTCG进行优选。在每lOOmlTCG冷冻保护液中分别釆用1.25g、1.65g和3・5g进行比较,制出合格精液

7、的次数为4/10、6/10、7/10o于是在TCG配方中的加入海澡糖剂量选定为3.5%。2.4甘油浓度的选择甘油是良好的冷冻保护剂，虽然目前已有儿种替代甘油化学试剂的报导，但效果都不如甘油。因而目前为止，廿油是家畜冷冻精液必须的保护剂。在牛的冷冻精液生产中,甘油的用量为7%〜9%。而在猪的冷冻精液研究屮，甘油既是不可缺少的冷冻保护剂，又伤害精了质膜完整性，影响受胎率。因此我们寻求低浓度甘油的试验见