保护剂在猪精液冷冻保存中的应用

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1、保护剂在猪精液冷冻保存中的应用李益得基金项目：湘中丘陵区生猪产业区域试验站和娄底职业技术学院科研课题（2011ZK007）资助。*作者：李益得（1985～），男，讲师，硕士；主要从事野生动物保护及特种经济动物养殖；E-mail：liyide198523@163.com李继仁（娄底职业技术学院湖南娄底417000）摘要：为了延长猪精液冷冻保存的时间，提高猪人工授精的受精率，本文综述了猪精液冷冻保存技术的发展简史，简要阐述了保护剂的作用机理，并着重介绍了常用的保护剂及其应用，以期为猪精液冷冻保存技术的后续研究提供参考。关键词：猪；精液；冷冻保存；保护剂Applica

2、tionofprotectiveagentinthecryopreservationofpigsemenLIYi-de*，LIJi-renLoudiVocationalandTechnicalCollege，Loudi,Hunan417000Abstract：Inordertoextendthetimeofcryopreservationofpigsemenandraisethefertilizationofpigartificialinseminationrate.Thepaperreviewedabriefhistoryofpigsemencryoprese

3、rvationtechniquesanddescribedbrieflythemechanismoftheprotectiveagent,andfocusesoncommonlyprotectiveagentanditsapplicationinordertoprovidereferenceforfurtherstudy.Keywords:Pig;Semen;Cryopreservation;Protectiveagent冷冻保护剂是猪精液冷冻能否成功的最重要因素之一，冷冻保护剂的发展方向是用无毒性、高效的冷冻保护剂完全取代甘油。但近些年来，有关新冷冻保护剂的研

4、究一直没有重大进展，甘油等有一定毒性作用的冷冻保护剂，在相当长的时间仍可能是精液冷冻中最常用的保护剂[1-2]。尽管甘油在冷冻过程中对精子有良好的保护作用，但对精子细胞的毒性作用及对受孕的抑制作用也日益引起人们的关注[3-6]。近些年来，关于冷冻保护剂的研究一直是精液冷冻领域中的一个热点[7-9]。本文着重介绍了常用的保护剂及其应用，以此加强对猪精液冷冻保护剂的深入研究，为今后在精液冷冻保存技术提供指导与理论依据。1猪精液的冷冻保存研究Ivanov在1926到1927年首次进行猪冷冻精液保存技术研究及冻精人工授精，Milovanov等在1930～1936年进行同

5、样试验，并最早成功地配制了猪精液冷冻的稀释液(葡萄糖-硫酸盐和葡萄糖-酒石酸盐)。早期的猪精液冷冻试验结果表明，冷冻后的精液中精子的存活率低，因为温度下降对猪精子质膜、超微结构和生化组成造成损伤[10]。1949年，甘油对精子的抗冻保护作用被发现，推动了猪精液冷冻保存技术发展。1956年，Polges成功得到冻精人工授精出生的仔猪[11]。1975年，Pursel发明简便的猪精液冷冻和解冻方法，并在同年对23头青年母猪进行颗粒状冷冻精液解冻后的人工授精，但受胎率和产仔数都明显低于本交，直到2000年，全世界冻精的应用还不到猪人工授精总量的1％。虽然猪精液冷冻保存

6、技术发展缓慢，但国内外有关专家始终在不懈探索，随着各种新的检测手段的建立，可检测到精子细胞质膜化学组成变化、通透性改变、表面基因的不同以及各种冷冻损伤，为分析各种因素的影响提供了确凿的科学依据。2002年，Thurston等分析了质膜表面基因限制性片段多态性，发现其中16个片段对冷冻结果影响较大。从而可看出个体差异对冷冻效果的影响。2006年，Ricker等用傅氏转换红外光谱仪(FTIR)和扫描电镜(SEM)检测到在低温下质膜膜相的变化，由于膜相变化，引起了膜通透性改变、活力下降、信号通路改变，直至引起细胞死亡。Brouwer等监测和定位了脂质过氧化物的代谢；F

7、raser等用改良的中性彗星实验评价DNA的损伤，DNA的完整对于自然受精和人工授精的受精率、胚胎的正常发育、胎儿和后代的生长至关重要[12-18]。2保护剂的作用原理2.1渗透性冷冻保护剂渗透性冷冻保护剂主要有甘油(Glycerol)、二甲基亚砜(Dimethylsulphoxide，DMSO)、丙二醇(Propyleneglycol，PROH)、乙二醇(EthyleneglycolEG)、木糖醇、乙酰胺、阿东糖醇等。这类抗冻剂多属于低分子中性物质，在溶液中易结合水分子，发生水合作用，使溶液的粘性增加，从而弱化水的结晶过程，达到保护的目的，在猪精液冷冻稀释液中

8、添加抗氧化剂(如SOD、