人外周血B淋巴细胞的分离与激活开题报告

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1、本科生毕业论文(设计)开题报告书题目人外周血B淋巴细胞的分离与激活学生姓名＿＿＿杨正＿＿学号＿＿＿08190148＿专业班级＿＿＿芙蓉生科0801班＿＿＿指导老师＿＿李峰＿教授＿＿＿＿2011年9月28日论文（设计）题目人外周血B淋巴细胞的分离与激活课题目的、意义及相关研究动态：课题目的：通过本论文的实施，熟悉和掌握人外周血淋巴细胞提取的一般方法，完成人外周血淋巴细胞的提取、鉴定及激活。研究意义及相关研究动态：淋巴细胞作为血液中白血胞的主要组成成分，是动物机体完成细胞免疫和体液免疫的重要基础，为抵抗外来侵害提供了完善的免疫防护机制。同时，淋巴细胞还具有寿命长，激活后可分裂、增

2、殖的特性，因此很适合于离体培养，为免疫学研究带来极大的方便。另外，利用体外培养的淋巴细胞进行抗癌研究、爱滋病治疗、新药研制已屡见不鲜。分离单个淋巴细胞技术是进行细胞免疫试验的重要技术之一，是进行各项细胞免疫检测的基础。分离所得的单个核细胞可满足许多实验需要，不仅用于淋巴细胞总数测定，还可以用于进一步纯化淋巴细胞，进行淋巴细胞分类鉴定及各种淋巴细胞功能测定。分离得到的人外周血单个核细胞，用anti-CD40和IL-4激活培养得到B淋巴细胞，激活的B淋巴细胞表面存在与NAP1相互作用配体。此实验为相关免疫学研究奠定了基础。课题的主要内容（观点）、创新之处：将分离得到的单个核细胞冷

3、冻储藏或制成细胞悬液，用anti-CD40和IL-4激活培养得到B淋巴细胞，将B淋巴细胞与NAP1（FDC-SP）融合蛋白体外诱导培养，然后再进行相关实验的研究。分离PBMC是一项常规工作，传统的是采用Ficoll密度梯度离心法，Ficoll是一种粘性强的液体，其比重为1.077，在一定离心力的作用下，比重大于淋巴细胞的红细胞及多核粒细胞等沉淀于分离液的底层，单个核细胞在分离液的界面上。操作时需将抗凝血作适当稀释，比较适用于少量血液的分离，在血量较多时要分成数管进行离心，十分不便，而且重复多次地开放性操作也增加了污染机会。IL-4促进B细胞MHCⅡ类抗原、FcεRⅡ/CD23

4、和CD40的表达，并增强B细胞提呈抗原能力，使免疫系统对小量抗原刺激发生免疫应答。增加FcεRⅡ/CD23(IgEFc段低亲和力受体)的表达，并释放可溶性CD23(sCD23)/IgE结合因子(IgE-BF)，与mIgE阳性细胞结合并诱导其分化，可能与促进Ｂ细胞IgE的产生有关。研究方法、设计方案或论文撰写提纲：研究方法：1.分离B淋巴细胞高浓度的Ficoll溶液粘性高，易使细胞聚集，故通常使用60g/L的低浓度溶液，密度为1.020，添加比重为1.200的泛影葡胺（urografin）以增加密度。国外常用商品Isopaque或Hypaque，故又称Ficoll-Hypaqu

5、e分层液，将适量340g/L泛影葡胺加入Ficoll溶液中即可配制成密度合适分层液。分离人外周淋巴细胞以密度为1.077±0.001的分层液最佳，因为人的红细胞密度为1.093，粒细胞密度为1.092，单个核细胞在1.076～1.090之间。分离时先将分层液置试管底层，然后将肝素化全血以Hanks液或PBS液作适当稀释后，轻轻叠加在分层液上面，使两者形成一个清晰的界面。水平式离心后，离心管中会出现几个不同层次的液体和细胞带。红细胞和粒细胞密度大于分层液，同时因红细胞遇到Ficoll而凝集成串钱状而沉积于管底。血小板则因密度小而悬浮于血浆中，唯有与分层液密度相当的单个核细胞密集

6、在血浆层和分层液的界面中，呈白膜状，吸取该层细胞，经洗涤、离心，重悬。本法分离单个核细胞纯度可达95％，淋巴细胞约占90％～95％，细胞获得率可达80％以上，其高低与室温有关，超过25℃时会影响细胞获得率。2.激活B淋巴细胞用含10％小牛血清的1640完全培养液(含RPMI1640,Herpes10mmol／L,青霉素、链霉素各100U／mL,10％小牛血清)调整细胞数2X10／mL,加入6孔板，每孔2mL，37℃5％C02培养箱培养6h，吸弃上清，用PBS轻洗2次，去除非粘附细胞，每孔加入含10%新鲜小牛血清的1640培养液2mL及细胞因子GM-CSF、IL-4(终浓度GM

7、-CSF100ng／mL，IL-450ng／mL)，置37℃5％CO2培养箱继续培养，每隔3d半量换液，加入全量细胞因子。每日在倒置相差显微镜下观察，培养7～10d收集细胞并鉴定。设计方案：分离B淋巴细胞稀释血液：取抗凝脐带血5ml与等量Hanks液或RPMI1640充分混匀配制离心分离液：吸取5ml淋巴细胞分层液置于刻度离心管中，然后将离心管倾斜45℃角，用移液器将稀释的全血沿管壁缓慢加至分离液上面（血液:Hanks液:淋巴细胞分离液的比例为1:1:1），应注意保持两者界面清晰离心：在18℃～20℃下