DNA重组与细胞转重组DNA的提取及酶切鉴定

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1、医学生物学研究技术与实验实验报告实验名称：DNA重组与细胞转化，重组DNA的提取及酶切鉴定-v实验目的1.CaCI2法制备感受态细胞（E.coliHB101）2.目的基因与载体的连接（c-myc+pBR322;粘端连接）3.重组质粒转化大肠杆并筛选转化体（HB101;Ampr)4.质粒DNA的小量快速制备5.质粒DNA的限制性内切酶酶切6.DNA的琼脂糖凝胶电泳二、实验原理4•细菌转化体外连接的DNA分子必须尽快引入寄主细胞，否则会很快降解，而且只有导入到细胞中后，才能进行繁殖或表达出具有一定生

2、物活性的蛋白，细胞转化是常用也是最有效的方法之_o能够作为重组体转化的受体，主要有动物细胞、植物细胞、微生物细胞等。导入受体细胞的途径重要有转化（转染），显微注射和电穿孔等多种不同的方式。可以根据不同的受体选择不同的导入方式。一般情况下，细菌一类的原核生物和酵母这样的低等真核细胞可用转化方式导入，而高等动植物细胞则需采用显微注射或电穿孔来进行。细菌转化是指裸露的(或纯化的)DNA被细菌吸收而导致基因转移的现象。2•感受态细胞细胞处于能够吸收DNA的状态称感受态，处于感受态的细胞称作感受态细胞。大

3、肠杆菌的感受态需诱导。野生型大肠杆菌并不容易转化，这是由于DNA无法进入野生型大肠杆菌的细胞。经过多年的努力，科学家们发现了一种方法可以増加细胞吸收外源DNA的效率。那就是用化学方法处理细胞，使其改变膜对DNA的通透性。这种细胞就称为感受态细胞，即细胞处于能摄入核酸分子时的生理状态。这种方法已经成为基因工程的常规技术，它对于我们利用体外DNA重组技术来了解真核和原核生物的基因功能特别重要。细菌的感受态有两种类型：一种是自然感受态(Naturalcompetence),自然感受态细可以自由地吸收D

4、NA,通过它来进行遗传转化；另一种是人工感受态(Artificialcompetence),在这种转化中，细菌发生改变使得它们能摄入外源DNA。枯草芽抱杆菌属于能够发展为自然感受态的细胞，大肠杆菌就属于需要人工处理的细胞。将对数生长期的细菌放入0°C的CaCI2低渗溶液中，细胞膨胀，形成原生质球，诱导感受态；DNA加入后，形成抗DNase的基磷酸钙复合物，粘附于原生质球表面，429热冲击,DNA分子能够通过质膜进入细胞。其进入细胞的方式是完整的双链DNA分子首先吸附到细胞表面双链DNA分子解链变

5、成单链，单链DNA分子一条进入受体细胞内，另一条被降解。进入细胞内的单链DNA则复制成双链环状DNA，随同复制子同时复制，并被转录翻译。将细胞混合物涂布于筛选培养基几小时，细胞得以恢复和复壮，转化基因得以表达，然后根据合适的选择条件可以区分转化细胞和非转化细胞。1•本次实验说明本次实验将用EcoRI和ClaI处理的1.4kbc-mycDNA片段在T4DNA连接酶的作用下，连接入同样经EcoR丨和ClaI切开的pBR322质粒载体上，以E.coliHB101菌株为受体细胞，用CaCI2处理受体菌，

6、使其处于感受态，然后与pBR322质粒共保SolutionIIpH12.6SolutionIIIpH4.8离心后去向染色体DNA氢键断裂，双螺旋解开不能复性沉淀中质粒I)NA氢键部分断裂，cccDN/互补链不完全分离复性上清中温，实现转化。pBR322质粒携带有抗氨节青霉素的基因，因而使接受了该质粒的受体菌具有抗氨节青霉素特性用Ampr表示。将经过转化后的受体细胞在含有氨节青霉素培养基上培养，只有转化体才能存活，而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨节青霉素的能力而死亡。4.质粒DNA的小量快速制备

7、分离质粒DNA的方法包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增;收集和裂解细菌;分离和纯化质粒DNAo本实验采用碱变性法抽提质粒DNA,是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。当以pH4.8的NaAc去调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色

8、体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质・SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。本实验就是利用碱性变性法抽提实验一中转化的两组含有c-myc目的基因片段的PBR322质粒DNA,并进行酶切测定。表1碱变性法提纯质粒DNA的原理简表变性和裂解丫液11（NaOH）（冊酸的中和作用）图1碱变性法提纯质粒DNA的原理示意图5.硅基质材料（树脂）与DNA双链相互作用的原理DNA分子中的磷酸二酯键骨架在盐溶液的作用下脱水，使得暴露的磷酸基团吸附硅胶。双链DNA分子一旦被硅胶吸附，一般的洗液不能将其洗脱下来，只有