dna-重组-酶切和连接

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1、Q&A关于质粒提取结果的分析预实验结果载体（3.65kb）123PETBlue质粒DNA的琼脂糖电泳（1%）Lane1：sample1Lane2：sample2Lane3：sample3一条带杂带预实验结果PETBlue质粒DNA的琼脂糖电泳（1%）Lane1：sample1Lane2：sample2Lane3：sample3两条带三条带DNA分子的大小琼脂糖浓度DNA分子构象染色剂的量电压缓冲液的组成缓冲液离子强度等等……分子克隆上册,第五章一条带123我们的结果PETBlue质粒DNA的琼脂糖电泳（1%）Lane

2、1：Marker；Lane2：sample1;Lane3：sample2;Lane4：sample31215000bp10000bp7500bp5000bp2500bp1000bp250bp34我们的结果质优量少，成功率低质优量足卫星菌落？？我们的结果???电泳行为异常???我们的结果可用电泳：尽量减少上样时间，减少扩散；样品尽量均匀分布于胶孔中；尽量远离边缘泳道Q&A关于实验中的安全问题关于酚-氯仿-异戊醇分层问题：下层作用问题：酚变性蛋白氯仿去除脂类，除酚异戊醇消泡，减少表面张力剪切关于酚：下层；氧化判断

3、基因重组－酶切和连接基因的克隆与表达专题之三剪切5’NNGOHpGATCCNN3’3’NNCCTAGpHOGNN5’BamHⅠHindⅢ+引物15’GTCGCGGATCCGATGTCACGGCCGAGAC3’CDS5’AGCTGTCATAAAGATGTCACGGCCGAGACTTATAGTCGCT…………………………………………………………………………….………………………………………AKPCDS………………………………….……………………………………………………………………………….………………………………………

4、……………………………………….CDS….CATGAAAGCCGCTCTGGGGCTGAAATAAAACCGCGCCCGG3’引物23’GAGACCCCGACTTTATTTCGAACAGCG5’BamH1HindⅢpETBlue-2ATGGCGATATCCCGGGAGCTCGTGGATCCGAAT引物1：5’GTCGCGGATCCGATGTCACGGCCGAGAC3’BamHⅠ引物2：5’GCGACAAGCTTTATTTCAGCCCCAGAGC3’HindⅢ5’pApCpGoHpApApTpTpCpGpT3’3’Tp

5、GpCpTpTpApApoHGpCpAp5’5’pApCpGpApApTpTpCpGpT3’3’TpGpCpTpTpApApGpCpAp5’Mg2+ATPT4DNA连接酶连接pETBlue-23.653kb酶切连接酶切pETBlue-AKP(5.2kb)pETBlue-23.653kb转化复苏pETBlue-AKP－AKPpETBlue-pETBlueAKP√酶切：370C，水浴酶切3小时(封口膜封口）酶切产物的纯化和盒回收：直接进行液体回收：每100uL溶液加入500uL溶胶液，其余的操作步骤同前。向柱子的正中央共

6、加20uL洗脱buffer，其余步骤同前。酶切反应体系管号核酸10xbufferKddH2OBamHIHandIIItube1目的基因AKP24uL3uL0uL2uL1uLtube2pETBlue-210uL2uL5uL2uL1uL实验操作－酶切每人做一至两份胶回收原理硅基质材料：小片段双链DNA高盐环境与其吸附低盐环境与其解离每100uL溶液加入500uL溶胶液,混匀。将液体转移至吸附柱，12000rpm离心30秒，去除废液漂洗:向吸附柱的正中央加入500uL漂洗液，12000rpm离心30秒，去除废液。重复一次。

7、空柱12000rpm离心2min，以彻底去除废液将吸附柱置于一新的干净无菌的1.5mLEP管中，向吸附柱的正中央加15uL无菌水，室温放置5分钟。12000rpm离心30秒，以洗脱DNA。再次向柱子的正中央加5uL无菌水，室温放置5分钟；12000rpm离心2分钟。合并回收液。SYBR检测回收产物避免乙醇对酶促反应的影响1%琼脂糖凝胶25mL(用1xTAE配)1uLGoldView样品：酶切DNA4uL+0.5uL10xloading质粒对照：未酶切质粒DNA2uL+0.5uL10xloading分子量Marker：

8、5uL80伏恒压电泳，结果凝胶成像分析注意：Marker上5uL时大概的量是50ng/条带上样精准上样顺序（对照）实验操作－酶切电泳分析*PV0V1V1’M2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp连接反应体系（20uL）目的基因AKP载体pETBlue-210xLigasebufferddH2OT4DNA连接酶XuLYu