质体介导转染法原理及其研究进展

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1、质体介导转染法原理及其研究进展脂质体也称人工细胞膜，是由脂质双分子层组成的，磷脂分子在水中可自动生成闭合的双层膜，从而形成一种囊状物被称为脂质小体，最初人们只是运用脂质体模拟膜的构造及其功能，从而发现了膜的融合及内吞作用。最早证明脂质体能把DNA十分有效地引入动物细胞的实验是从鼠/人杂种细胞系(HGPRT-)中分离出的中期染色体包裹到脂质体中，并用以转染HGPRT一的细胞，结果转化率比裸露染色体高十多倍，而且转化子能稳定地表达HGPRT-的活性。脂质体法具有很多优点，操作简便，转化效率比较高，可以用于瞬时转染，也可以用在永久表达系的建立，对细胞类型的运用面广，对转染的核酸类型和分子量有很高的

2、包容性，细胞毒性小，也可以用于体内的基因转染。因此脂质体转染法得到了越来越广泛的应用。1脂质体的组成和制备1.1脂质体的组成磷脂是一种双亲(亲水亲脂)脂分子，在水环境中可自发地形成双层膜,Bangham首次鉴定了呈微球形的脂类双分子层。制备脂质体的主要材料是天然磷脂和类固醇，因而是生物可降解的、无毒的和不致免疫的。脂质体的种类很多，概括起来有多层脂质体和单层脂质体，通常使用“囊泡”一词来描述不同类型的脂质体，例如有多层大囊泡(MLV)、单层巨型囊泡(GUV)、单层大囊泡(LUV)、不同组成的脂质体其表面电性会不同，表面电荷为阳性、阴性和中性的脂质体对细胞的转染频率也会有差别。现存的商业化脂质

3、体均为阳离子脂类与中性脂类的复合体,如Lipofect、AMINE、Lipofectin等,屮性脂类多为二油酰磷脂乙醇胺(DOPE),其屮阳离子脂类起主要作用，通过静电作用与DNA形成DNA■脂复合体，并引导DNA进入细胞，DOPE起辅助作用，去稳定脂质和胞内促DNA释放，称为辅助脂类。阳离子脂质体主耍分为三类:(1)人工合成的阳离子去垢剂与DOPE组成，它有两条疏水碳氢链和一个季鞍离子极性头部。如Lipofectin0(2)天然脂经过修饰接上一个阳离子基团与DOPE组成，如胆固醇共价接一个二甲基乙基甲酰镀或磷脂酰胺接聚赖氨酸或多胺。⑶天然碱性脂与DOPE组成，如硬脂胺(SA)为已知的唯一纯

4、天然的脂类。1.2脂质体的制备方法脂质体的制备主要有超声波法、磷脂酰丝氨酸Ca2+离了融合法和逆相蒸发等，用超声波法可制备的单层或多层脂质小体能向细胞内引入的物质量少，故常用后两种方法制备大的脂质体。2脂质体介导转染的机制阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用，将DNA分子包裹入内，形成DNA■脂复合体，也能被表面带负电荷的细胞膜吸附，再通过融合或细胞内吞作用进入溶酶体。内吞后的DNA■脂复合体在细胞内形成的包涵体，在DOPE作用下，细胞膜上的阴离子脂质因膜的不稳定而失去原有的平衡扩散进入复合体，与阳离子脂质中的阳离子形成中性离子对，使原来与脂质体结合的DNA游离出来，进入细

5、胞质，进而通过核孔进入细胞核，最终进行转录并表达。辅助脂质体DOPE含乙酰胺头部，在溶液中形成六角形引起脂质高度弯曲，对脂双层具有去稳定作用，可使细胞膜和包涵体膜去稳定，在DNA■脂复合体的内吞和DNA从包涵体的释放两个关键步骤屮起作用。3脂质体介导转染法的改进方法3.1促进转染的脂类Paukku等首先使用了鞘氨醇(SP)及其衍生物作为阴离子脂质，发现用植物鞘氨醇：DOPE：DC(4：2：0.3)转染真核细胞具有高效率低毒性，比Lipofectin转染率高2・10倍。Kao使用鞘氨醇也得到了同样的结果，说明鞘氨醇形成的脂质体是一种较好的转染介质。硬脂胺(SA)作为转染介质具有高的转染率和运用

6、细胞种类的多样性，SA是迄今为止唯一的一种纯天然脂质体。因其对细胞的毒性小而广泛应用于体内和体外转染，用SA、脂染素和磷酸钙对21种不同的细胞株对比实验中，SA可转染8种，磷酸钙只能转染4种，脂染素有4种不能转染。胆固醇及其衍生物作为阴离子脂质同样能高效率转染细胞，Ghosh等用3种不同的胆固醇衍生物和DOPE形成的脂质体转染细胞均获得了较高的转染率。由于存在血清，体内转染时一般的转染介质效率均不高，Kikuchi等应用DC6-14：DOPE：Chol(l：0.75：0.75)在10%PBS存在下进行体外转染，得到了高的转染率，体内转染也同样有效，这样说明胆固醇型衍生物是一种高转染介质。3.

7、2增加转染效率的添加剂脂质体・DNA复合体中加入一些阴离了物质能促进复合体与细胞膜的融合或DNA的释放。在DNA与脂质体混合前预先用磷酸盐缓冲液处理脂质体能提高含荧光素酶基因的DNA和mRNA质粒转染后的荧光素酶的表达量，分别为26倍和56倍。硫酸精蛋白(USP)是一种聚阳离子多肽，它是通过精蛋白分子中精氨酸残基浓缩质粒DNA来增加转染率，这种作用力的大小与精蛋口的结构有关，与其所带电荷无关。一些短链磷脂促进