麝香壮骨膏控制菌检查的方法学验证

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1、麝香壮骨膏控制菌检查的方法学验证橡胶膏剂是指药物或药材提取物与橡胶为主的基质混合后，涂布于裱背材料上的外用剂型。麝香壮骨膏为片状橡胶膏剂，具有镇痛、消炎之功效，用于风湿痛、关节痛、腰痛、神经痛、肌肉酸痛、扭伤、挫伤。《中国药典》（2010年版）一部对橡胶膏剂新增微生物限度检查项目，每10cm2不得检出控制菌（金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌）。按照《中国药典》（2010年版）一部附录II及附录XIII的要求，对麝香壮骨膏进行了微生物限度检查方法及方法学验证的试验研究，建立了麝香壮骨膏控制菌的检查方法。1仪器与材料1.1仪

2、器仪器采用SHZ-82A型水浴恒温振荡器（金坛市城西天竟实验仪器厂）;YXQ-LS-50型立式自动电热压力蒸汽消毒器（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）:DHP-600电热恒温培养箱（北京永光明医疗设备厂）;DHG-9075A型电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）o1.2样品样品为麝香壮骨膏（东阿阿胶医疗器械有限公司药业分公司国药准字：批号：12020112>12020805>12020705）,主要成份：人工麝香、生川乌、生草乌、薄荷脑、水杨酸甲酯、冰片、山奈、白芷、樟脑、硫酸软骨素、盐酸苯海拉明、麻黄、八角茴

3、香、苍术、当归、干姜。1.3菌种与培养基大肠埃希菌［CMCC(B)44102］、金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26003］、铜绿假单胞菌［CMCC(B)64941］、枯草芽砲杆菌［(CMCC(E)63501］、白色念珠菌［(CMCC(F)98001］、黑曲霉［(CMCC(F)98003］,以上菌种均购自中国药品生物制品检定所，传代次数不超过五代。培养基为营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基、漠化十六烷基三甲较琼脂培养基、营养琼脂培养基(批号分别为1203132、1003182、100129、1110

4、082、1103162)均为北京三药科技开发公司生产。0.9%氯化钠注射液，pH7.0氯化钠-蛋白腺缓冲液和聚山梨酯-80均按《中国药典》(2010年版)一部附录配制。2方法与结果2.1验证用菌液的制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的新鲜培养物于营养肉汤培养基中，恒温培养箱30〜35°C培养18〜24h。将上述三种培养物用0.9%氯化钠注射液稀释为每1ml含菌数为10〜100cfu的菌悬液作为验证用菌液。2.2供试液制备2.2.1稀释剂制备配制各种稀释液，pH7.0氯化钠-蛋白腺缓冲液200ml,分别加

5、入5g、10g.20g、30g和40g聚山梨酯-80,混匀；对麝香壮骨膏进行供试液制备试验，采用振荡法观察分散情况，确定合适的稀释剂。结果聚山梨酯-80为30g和40g供试液较黏稠且有明显的油水分层，影响供试液的吸取，不便于检验操作;聚山梨酯-80为5g和10g的供试液均较澄清，溶解不充分。所以最终选用pH7.0氯化钠-蛋白月东缓冲液200ml加入20g聚山梨酯-80作为稀释剂。2.2.2供试液制备取供试品4贝占，去掉保护层，放置在无菌玻璃器具上，粘贴面向上。用无菌纱布覆盖粘贴面，共剪取大小约100cm2的块状，然后

6、将其置于100ml稀释剂中，置40°C水浴恒温振荡器中，频率为200转/分，振荡30min,制成1:10的供试液。2.2.3阴性对照稀释剂作为阴性对照液2.3试验方法2.3.1金黄色葡萄球菌试验组：分别取供试液10ml和1ml的金黄色葡萄球菌验证菌液，加入100ml营养肉汤培养基中；供试品组：取1供试液10ml加入100ml营养肉汤培养基中；阴性菌对照组：分别取供试液10ml和1ml的大肠埃希菌验证菌液，加入100ml营养肉汤培养基中;阴性对照组：阴性对照液10ml加入100ml营养肉汤培养基中。上述各组置30〜35

7、°C恒温培养箱内培养24〜48h,分离划线于甘露醇氯化钠琼脂平板上，依照金黄色葡萄球菌的检查方法进行检查。2.3.2铜绿假单胞菌试验组：分别取供试液10ml和1ml的铜绿假单胞菌验证菌液，加入100ml胆盐乳糖培养基;供试品组：取供试液10ml加入100ml胆盐乳糖培养基；阴性菌对照组：分别取供试液10ml和lml的大肠埃希菌验证菌液，加入100ml胆盐乳糖培养基；阴性对照组：阴性对照液10ml加入100ml胆盐乳糖培养基。上述各组置30〜35°C恒温培养箱内培养24〜48h,分离划线于漠化十六烷基三甲鞍琼脂平板上，

8、依照铜绿假单胞菌的检查方法进行查。3分析与讨论橡胶膏剂中除了主要药用成份外，基质主要为橡胶、凡士林、液状石蜡和羊毛脂等高分子材料，因此选用合适的溶剂来制备供试液，是橡胶膏剂微生物限度检查中制备供试品溶液很关键的步骤。因橡胶、松香、松香衍生物、凡士林、羊毛脂等橡胶膏剂基质试验中不易找到可使背衬层与药物贴库层、粘胶层分离的适宜溶剂，故选用pH值为7