陈应广论文正文

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1、引言［(加黑，小四)优良品种是作物获得高产的基础，而品种混杂和纯度降低会明显降低产量。快速准确地鉴定品种对于种子质量标准化、品种审定、假种辨别、产权纠纷均有重要作用。目前，我国棉花生产、经营还不太规范，一些不合格的种子屡屡混入市场并用于生产，不但造成减产，有时还导致巨大损失，因此品种鉴定就显得尤为重要。早期，人们采用形态学方法对品种进行识别，该方法简便、经济，但是由于许多形态学性状鉴定周期长、受环境影响大⑵。并且随着育种亲本的利用集中化，品种鉴定愈来愈困难，传统的形态学方法也就越不适应品种鉴定和纯度分析。SSR指纹图谱技术

2、的出现很好的解决了这个难题。SSR(SimpleSequenceRepeat简单序列重复)，亦称为微卫星，是一种核生物基因组中普遍存在的重复序列，重复序列一般由1・6个碱基组成，重复次数在不同物种或同一物种不同遗传背景之间是高度可变的⑶。这些重复序列两端大多是保守的单拷贝序列，因此可以根据保守序列设计特异引物，通过PCR技术将中间的核心重复序列扩增出来，利用琼脂糖电泳或聚丙烯酸胺凝胶电泳分析技术可获得其长度多态性。这种多态性差异表现为重复单位，碱基数目的整倍数，这一多态性成为简单序列重复长度多态性(SSLP)。SSR标记的

3、等位基因变异来源于基因组DNA复制时的滑动引起的重复序列数目的变化，而不是单碱基突变或插入缺失造成的，因而表现出高度的多态性。SSR标记应用于棉花品种，杂交种的鉴定和种子纯度的检测，具有很大的优越性。SSR标记的引物是根据重复序列两端相对保守的单拷贝序列设计，其扩增产物稳定，建立的指纹图谱可靠。它作为共显性标记，比显性标记提供更多的信息，尤其适用于自交系，杂交系的纯度鉴定。标记的位点又具有复等位性，可在种内的栽培品种间易获得多态性标记位点⑴。此外，标记是基于技术，它不仅有利于标记分析的自动化，而且对基因组的质量要求相对较低

4、，DNA用量较少，适合于SSR标记的大量快捷分析。棉花是世界上最重要的天然纤维作物，也是重要的油料作物之一。在分类学中，棉花属于被子植物中的锦葵目(Malvales)、锦葵科(Malvaceae)、棉属(Gossypium)0棉属甸括大约45个二倍体种和5个异源四倍体种，分别原产于非洲、中美洲、南美洲、亚洲、澳洲、Galapagos岛和夏威夷地区。根据各个种染色体组之间的同源关系可将棉属二倍体种划分为A、B、C、D、E、F、G和K8个染色体组类型。二倍体种的染色体基数都是n=13,它们单倍体基因组的大小为l.O・3.5Gb

5、,不同二倍体棉种基因组大小的变化主要与基因组中散布重复序列的含量有关⑺。百棉系列棉花品种是由河南科技学院棉花研究所培育的陆地棉品种，表现出早熟不早衰、有后劲、优质、高产、抗逆抗病虫性好等特性。本课题选取陆地棉自交系，通过构建构建SSR指纹图谱，为今后棉花种质资源鉴定、遗传连锁图谱绘制、目标性状基因的定位以及自交系遗传变异分析、杂种优势群的划分等提供理论依据和物质基础。1材料与方法1.1供试材料百棉1号、百3母、百3父、百068（百13）、07区5（百12）.百078（A6,百11）,其它背景材料包括：鑫秋1号、晋棉36、冀

6、958、泗棉3号、徐州514、邯802、国欣棉3号、泗棉4号、鲁棉研29、晋棉29、中64（夏）、新路1号、科棉4号、辽19（夏）、鲁棉研28、中50（夏）、豫15、中41、中植棉2号、徐州142、渝棉1号、中9603、鲁棉研21、SGK958,中45、百169、邯885、国丰2号、冀丰522、中58（夏）、国丰6号、晋棉45、鲁棉研19（夏）、百011、大圆铃、10号，共45个陆地棉品种。1・2样品采集及DNA的提取采取棉花幼叶1・2片以备提取DNA。方法如下：（1）称取3克新鲜棉花幼嫩子叶于研钵中，加入液氮迅速研磨成粉

7、末，然后转入一个50ml离心管中，并加入15ml己65°C预热的CTAB裂解缓冲液，充分混匀后置于65°C水浴20~30min,并不时混匀。（2）向每管加入15ml氛仿:异戊醇（24:1）颠倒使充分混匀。（3）16°C、4000rpm＞离心lOmin吸取上清至另一个lOml离心管中。（4）加入等体积氯仿:异戊醇（24:1）,再抽提一次，颠倒混匀。（5）4°C.40（）（）rpm、离心lOmin。（6）加入0.6倍体积的冰冻异丙醉，可见丝状或絮状沉淀，即为DNA粗提物。（7）勾出DNA,加入70%乙醉，浸泡2~3小时，中间更

8、换2〜3次。（8）室温风干，加入700ulTE（pH8.0）,至DNA完全溶解。（9）加入1OulRNaseA.37°C水浴30mino（10）加入等体积的酚：氯仿（1:1））昆匀。（11）4"C、lOOOOrpm.离心lOmin。（12）吸取上清至另一1.5ml离心管中，加入等体积氯仿:异戊醇（24: