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1、细胞株在适当的培养基中保持10%FBS。从Addgene(质粒)购买HA-FLAG-UCHL3。#22564，然后再克隆到pGEX-4T-2载体(Clontech)中。UCHL3C94A和S75A突变体由位点定向突变层积产生)。抗uchl3抗体购自ProteinTech公司(12384-1-ap)。抗ub(P4D1)、抗rpa32(9H8)、抗brca1(D9)抗体购自SantaCruzBiotechnology。抗rad51(N1C2)是从GeneTex购买的。反γH2AX(05-636),anti-BRCA2(OP95)和anti-MDC1(05-1572)从微孔被
2、购买。Anti-BRCA2(推上a303国道-435a)和anti-γH2AX架a300型(-081a)从Bethyl购买实验室。抗53bp1(NB100-304)购自NovusBiologicals。Anti-Flag(m2)、anti-HAanti-β-actin抗体购买的σ。反磷（血清/thr）atm/atr衬底抗体（2851）是从细胞信号技术中购买的。CRISPR/Cas9敲除(sgRNAs)使用:sgUCHL3-1(5′-GCCGCTGGAGGCCAATCCCGAGG-3′)和sgUCHL3-2(5′-GCCCCGAAGCGCGCCCACCTCGG-3′)。g
3、RNA序列被克隆到载体中。LentiCRISPR-V2-puro。细胞被慢病毒感染sgRNA-puro随后与2μg/毫升嘌呤霉素广泛的选择,和单一的克隆是通过连续稀释和放大。通过免疫印迹鉴定克隆抗uchl3抗体，并通过DNA测序验证。重组蛋白表达和下拉试验。构建表达His-RAD51和GSTUCHL3蛋白的质粒，构建RAD51和UCHL3的编码序列被亚克隆为pET-32a和pGEX-4T-2。为了产生重组蛋白，每个表达结构都转化为大肠杆菌BL21(DE3)。总之,在LB培养基培养细菌在37°C到1.2(OD600)和冷却30分钟在冰上。然后细胞连续培养15h在18°C添
4、加0.8毫米isopropyl-b-D-hiogalactopyranoside之后(IPTG)。细胞然后用超声波提取和裂解。细胞溶解产物用16000g离心30min，得到的上清液与他的MagSepharoseNi(GEHealthcare)孵育，纯化His-rad51蛋白和GSH珠(Promega)，纯化分别是GST和GST-uchl3蛋白。体外GST-UCHL3拉试验,50µg重组GST和GST-UCHL3蛋白质绑定到谷胱甘肽珠子被5%BSA在4°C2h其次是孵化与50µgHis-UCHL3额外2h在4°C。然后用不同盐浓度的NETN缓冲液冲洗5次。结合蛋白被筛选了
5、1×SDSPAGE缓冲与加热10分钟在95°C。用单克隆抗his抗体检测His-RAD51，用Coomassieblue染色GST-UCHL3体内变性去泛素化实验和体外脱泛素化实验对于体内去泛素化实验，控制U2OS细胞，UCHL3敲除U2OS细胞，或UCHL3敲除U2OS细胞稳定表达HA-UCHL3野生型和突变Cys95阿拉巴马州(CA突变)在120年被细胞溶解μL62.5毫米Tris-HCl(pH值6.8),2%SDS、10%甘油,20毫米NEM,1毫米碘乙酰胺;煮15分钟;用含有蛋白酶抑制剂的NETN缓冲液、20mmNEM和1mm碘乙酰胺进行测定10次;然后离心分离
6、细胞碎片。细胞提取物的免疫沉淀与指示抗体和涂抹抗ub抗体。为了制备大量泛素化蛋白作为体外脱泛素实验的底物，HEK293T细胞与Myc-RAD51和His-Ubexpression载体一起转染。在变性条件下，用他的珠子从细胞提取物中纯化泛素蛋白。接下来，用Ub-RAD51蛋白从细胞提取物中纯化抗myc-琼脂糖颗粒在裂解缓冲液(50mmTris-HClpH)中7.8,137毫米NaCl,10毫米NaF,1毫米EDTA,1%TritonX-1000.2%萨科齐，1mmDTT,10%甘油，新鲜蛋白酶抑制剂)。重组GST-UCHL3和UCHL3CA在BL21细胞中表达，按照标准方
7、案纯化。deubiquitination测定体外,ubiquitinated蛋白质是孵化与重组UCHL3eubiquitination缓冲区(50毫米Tris-HClpH值8.0,50mM氯化钠,EDTA1毫米,10毫米德勤,5%甘油)4h30°C。芯片通过转染I-SceI表达质粒，在U2OSDR-GFP细胞中诱导单个DSB。转染后24小时，细胞在室温下用1%甲醛固定10分钟，将蛋白质与DNA交联。加入甘氨酸(0.125M)5分钟，停止交联。细胞被收获,颗粒在细胞裂解缓冲resuspended(5毫米管道(KOH)在pH值8.0,85毫米
