单链抗体在肿瘤治疗中的应用

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1、单链抗体的研究进展摘要：杂交瘤技术创立以來，单克隆抗体在临床疾病的诊断和治疗中发挥了巨大作用。但是单克隆抗体存在分子量大，免疫原性强，体内滞留时间长，不易穿透组织，血管通透性差等缺点，使得单克隆抗体在临床实际应用存在一定的局限性。所以制备小分子抗体，对于肿瘤的诊断和治疗具冇重要的意义。单链抗体(single-chainFv,scFv)是目前研究最广泛的小分了抗体，本文就单链抗体的研究进展及在肿瘤的诊断和治疗中的应用作一综述。1.单链抗体的研究1.1抗体工程的发展抗体具冇极为广泛的应用，其制备技术经历了三个阶段，

2、即多克隆抗体一单克降抗体一基因工程抗体。多克隆抗体(polyclonalantibody,PcAb)是用包含多个抗原表位的抗原物质免疫动物，从而刺激多个B细胞克隆产牛针对多种抗原表位的不同抗体。所获得的免疫血清称为，实际上是含有多种抗体的混合物，常有交叉反应。而门多克隆抗体产量有限，批次内个体差界较大、批次间的差异更难以预料，在实际中难以实现规模化应用。1975年,Kohler和M订stein建立了B淋巴细胞杂交瘤技术[1],成功制备了只针对某一特定抗原决定簇的单克隆抗体，开辟了抗体技术的新时代。但是单克隆抗体

3、存在制备麻烦,分了虽大，免疫原性强，特异性差，半衰期短，透性差等缺点，使得单克隆抗体在临床实际应用存在一定的局限性[2-3]o随着分了生物学及分了免疫学等学科的飞速发展，基因工厂抗体应运而生，通过对基因进行改造，制备了一系列基因工程抗体。人鼠嵌合抗体，人源化抗体的成功制备，很人程度上解决了单克隆抗体使用过程小遇到的问题。抗体库技术的岀现使得完全人源化抗体的制备成为可能。冃前，研究最多的是单链噬菌体抗体库。1.2单链抗体的结构单链抗体是将抗体的重链町变区(VG和轻链可变区(Vl)通过一段连接肽(接头，linker

4、)连接成的重组蛋白，结构有-两种：VH・linke「VL或VH・linke「VL,两种结构被证明对于单链抗体的亲和力和特异性差异不大，其分子量大小仅为完整抗体的1/6[4]。Linker的设计对于scFv的表达水平、稳定性、可溶性、亲和力有重要影响，而且其长度及性质不应干扰Vh和Vl的折叠，不引起分子动力学改变，并几不对抗原结合部位有妨碍。一般接头大小在15-25个氨基酸，目前，应用最广泛的接头是15肽(Gly4Ser)3【5］。氨棊酸是分了量最小侧脸最短的氨棊酸，可增加侧链的柔韧性；丝氨酸是亲水性最强的氨基酸

5、,可增加其亲水性。还可以根据不同的目的设计不同的linker,例如,小于12个氨基酸的linker可以使同一抗体分子的重链和轻链Zl'可无法配对，从而促进促进不同的两个或多个抗体分子之间相互配对,形成可以结合多个抗原决定簇的结合位点，可以增强抗原结合位点,即单链抗体多聚体［6］。scFv具冇免疫原性小，可最大限度地减少异种蛋白引起的免疫反应；组织穿透能力强，容易进入实体瘤内部；半衰期短，体内清除速度快，毒性小；因为不具备Fc段，不能与Fc受体阳性的细胞结合，可以避免非特界性杀伤；且体内成像吋本底较低，成像定位检

6、查吋图像清晰等优点［7,8］o1.3单链抗体的來源单链抗体町变区基因一般从杂交瘤细胞、免疫小鼠的脾细胞、人外周血淋巴细胞等來源的mRNA作为模板，根据町变区设计引物，通过RT-PCR扩增得Vh和Vl基因［9］。杂交瘤法是使用通用引物及PCR技术从杂交瘤、不稳定杂交瘤的融合体、单个杂交席细胞或是单个人、鼠B细胞中获取可变基因，通过linker拼接，克隆到表达载体，在大肠杆菌中表达，但是这种方法操作繁琐，需耍进行细胞融合等缺点。噬菌体抗体库技术的出现使得抗体及抗体片段的制备简便易行，稳定冇效，同时也使人源化抗体的制

7、备成为了可能。1.4存在的问题单链抗体是单价抗体，只有一个抗原结合位点，所以功能比较单一。稳定性差，单链抗体的重链和轻链Z间的相互作用力比佼弱，故而容易形成二聚体或多聚体，具有聚集倾向；半衰期短，在体内难以维持一定的血药浓度。亲和力较亲木的单克隆抗体低。单链抗体的木身特点使得其在临床应用上存在一点的局限性，制备单链抗体多聚体及双特异性单链抗体,能够在一定程度上克服传统单链抗体的缺点［10］。1.噬菌体抗体库技术2.1噬菌体展示技术噬菌体展示技术(phagedisplay)是外源蛋口的基因克隆到噬菌体的基因组小，

8、与噬菌体外壳蛋口融合表达，从而将外源蛋口表达于噬菌体表的技术［ll］o噬菌体易于在人肠杆菌系统扩增及分离，该技术对以将扩增及选择联系在一起，通过与配休的结合实验从数量众多的群体中筛选出能打特定呢体结合的噬菌体颗粒，再感染人肠杆菌使筛选出的噬菌体颗粒扩增。phagedisplay己成为非常有效的筛选体系，其抗体库技术也已成为筛选较高亲和力抗体或片段的重要來源［12］。2.2噬菌体单链抗体