资源描述：
《临床医学毕业论文抗人硫氧还蛋白1单克隆抗体的制备与鉴定及初步应用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、XX大学毕业论文抗人硫氧还蛋白1单克隆抗体的制备与鉴定及初步应用姓名：2014年6月25日抗人硫氧还蛋白1单克隆抗体的制备与鉴定及初步应用作者：唐文心，王建和，陈正望，陈孝平【摘要】目的：制备抗硫氧还蛋白1(TRX1)的单克隆抗体(mAb)并进行特性鉴定。方法：以原核表达的TRX1为抗原免疫BALB/c小鼠，按常规方法进行细胞融合。采用有限稀释法和间接ELISA法克隆和筛选阳性杂交瘤细胞株，用ELISA检测mAb腹水的效价、相对亲和力和进行表位分析，用Westernblot法对mAb的特异性进行鉴定。结杲：得到筛选出3株能稳
2、定分泌抗TRX1的杂交瘤细胞株B6、D5和E3,免疫球蛋白亚类均为IgGl(k),腹水mAb效价均在106以上,3株抗体分别针对不同抗原表位。用mAb建立的竞争抑制ELISA灵敏度达1.22
3、ig/Lo结论：获得3株特异性好、亲和力高、能稳定分泌抗TRX1的杂交瘤细胞株，为研究TRX1在人类细胞、血液、组织屮的表达及定位提供了可能，并为探索相关炎症、癌症发病机制及新治疗方法提供了强有力的工具。【关键词】人硫氧还蛋口1单克隆抗体竞争抑制ELISA硫氧还蛋口1(thioredoxin1,TRX1)相对分了质量(Mr)约为1200
4、0,属于进化保守的氧化还原蛋白家族，具有活性中心(TrpCysGlyProCysLys),它与TRX1述原酶和NADPH共同构成调节细胞氧化还原状态的铳基氧化还原系统(TRX系统)o1964年TRX1在大肠杆菌中首次被发现至今［1］,被证实广泛存在丁原核、真核生物屮，具有多种重要功能，如抑制细胞凋亡、增加转录因了活性，刺激细胞增殖及血管生成，作为DNA合成的辅助因子［2］。临床研究发现，在氧化应激及炎症状态下包括HIV感染、类风湿性关节炎、Sjogren,s综合症、急性冠状动脉综合征和扩张性心肌病等，患者血清中TRX1水平将
5、大大提高。更有趣的是,许多人类恶性肿瘤中均发现TRX1的过表达，包括肺癌、直肠癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、淋巴癌等［3］,故将TRX1作为一项病理指标并提示可将TRX1及TRX1系统作为癌症治疗的新靶点，貝有潜在的应用价值。1材料和方法1」材料表达载体pET32a,pcDNA3.1什）大肠杆菌DH5a和BL21,人乳腺癌细胞MCF7细胞株出本实验室保存。MMLV反转录酶，DNA限制性内切卿，T4DNAligase,KlenowiW,pfu聚合iW和dNTP购自TaKaRa公司。IPTG酵母提取物及胰蛋⑷东为OXOID公司
6、产品。肌动蛋白（卩actin）及其单克隆抗体（mAb）、微管蛋白（卩tublin）及其mAb、牛血清白蛋白（BSA）、BCA试剂盒及DMEM培养基均为Sigma公司产品。弗氏佐剂为GibcoBRL公司产品。4〜6周龄雌性BALB/c小鼠（体质量18〜22g）购自湖北省实验动物研究屮心。Sp2/0细胞由屮国农业大学传染病与微生物学教研室提供。IW联免疫检测仪为Labsystemsdragon公司产品。SephadexG25凝胶柱为Phamarcia产品。IgG亚类（型）ELISA检测试剂盒为Pierce公司产品。其他试剂均为国
7、产分析纯。1.2方法1.2.1TRX1的原核表达及纯化由上海生工生物工程技术服务冇限公司合成引物对：P15'CGGAATTCAATGAACGGCCCTGAAGATCT3：P25，CGGAATTCTCAGCAGCCAGCCTGGAGGA3仁提取人乳腺癌细胞MCF7总RNA,用MMLV反转录成cDNA,以此cDNA为模板，P1和P2作为引物，用高保真DNA聚合酶pfu进行扩增，反应程序为:94°C30s,55°C60s,72°C40s,循环30次。其产物和pcDNA3.1（+）载体连接得到pcDNATRX1o使用KpnI和Xho
8、I将从pcDNATRX1上将TRX1基因切下后克隆到pET32a的相同位点中，得到原核表达载体pET32aTRX1。提取pET32aTRX1质粒转化大肠埃希菌BL21工程菌，以单菌落接种于LB培养基（含氨比西林50mg/L）中振荡培养过夜，1%转接后继续振荡培养至A值为0.5,加0.4mmol/LIPTG诱导表达。将BL21重悬于预冷的Tris缓冲液(pH7.9,含5mmol/L咪哇，0.5mol/LNaCl和20mmol/LTrisHC1)中，加入10g/LTritonX100后超声破碎，12000g,10min离心后取上
9、清。将超声后的上清以15mL/h的速度过Ni亲和柱，再用20倍柱床体积的PBS(含0.5mL/LTween20)洗柱3次，以洗脱杂蛋白，再加入100pg/unitthrombin蛋白酶于22°C轻柔振荡16h,用8mL的PBS洗脱，收集洗脱液。再用100mmol/L咪呼洗脱标签蛋白。1.2
