酶的纯化与结构鉴定的研究进展

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1、酶的纯化与结构鉴定的研究进展——微生物脂肪酶的纯化和结构鉴定扌商要：本文综述了酶的分离纯化和结构鉴处上的常用方法及最近其它较有发展前呆的纯化技术在酶分离纯化的应用，并以微生物脂肪酶为例，介绍了常见的微生物脂肪酶分离纯化方法，如沉淀法、层析法、膜处理、免疫纯化和反胶团系统等纯化方法。同时对酌的-主耍结构鉴定方法做了一些简单的介绍。关键词：微生物脂肪酹；纯化；结构鉴定AdvancesinprocessforMicrobiallipasepurificationandstructureelucidationPurificationmethodsstruct

2、ureelucidationoftheMicrobiallipaseAbstracts：ThearticlereviewsthecommonmethodsinthePurificationandstructureelucidationandtherecentandpromisingtechnologyinthepurificationoftheenzymeseparationandpurificationoftheapplication,Takemicrobiallipaseasanexample,introducethecommonmicro-or

3、ganismslipaseseparationandpurificationmethods・Suchasprecipitation,chromatography,membranetreatment,immunizationandanti-Micellepurificationsystemsandotherpurificationmethods.Atthesametime,thearticlegivesabriefintroductioninthestructureelucidation.KeyWords:Microbiallipase;purific

4、ation;structureelucidation1前言一种生物体含有数以千计的不同的分子，他们包含复杂的高分子两化合物，例如蛋白质、核酸、碳水化合物和复合脂肪以及小分子的有机酸、碱、糖和盐。其中很多蛋H质具有酶的活力。生物体在细胞水平上的精确地组织使得酶的分布不是均一的。酶的來源多为生物细胞。生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但每-•种酶的含量却很低,如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却差别很大。因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。如果希望

5、测定温度对水果和蔬菜中一些酶失活的影响，以便在加工中设计适当的热烫条件，可以按下述的步骤进行：将经热处理后的样品在特殊的缓冲液均质化，用离心的方法除去不溶解的物质，然后检验上清液中酶的残余活力。因为酶是十分特异的，因此，可以采用不同底物测定上清液中不同的酶的活力。因为有许多酶有可能作用于同一底物，因此，这样的检验是粗糙的。例如，用蛋片质作为底物时，实际上测得的是体系中所有蛋白酶的综合的催化活力。当然，通过改变pH或采用更为特异的底物，是能够区别这些蛋白酶的活力的。例如，虽然胃蛋白酶和朕蛋白酶都是水解蛋白质，但是胃蛋白酶的最适pH为2,而胰蛋白酶为8,

6、或胃蛋白酶在PH8时无活力，而朕蛋白酶在pH2时无活力。因此，能够分别地测定存在于同一溶液中胃蛋白酶和胰蛋白酶的活力。胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的最适pH都在8左右，如果采用特异的底物N-乙酰酪氨酸乙酯和N-苯甲酰-1厂精氨酸乙酯，能分别测定朕凝乳蛋白酶和胰蛋白酶的活力。在上述的例子中，即使我们仅需要测定酶的大致的活力，也有必要做一些初步的分离工作，以除去抑制剂或其他会干扰测定的物质。如果需要研究一种酶的氨基酸组成、分子量、三级结构、底物特异性或动力学参数，那么就必须将酶与所有的其他物质分离。在这种情况下，酶的纯化将是一项重要的任务⑴。2酶的纯化方法提取

7、液中含有多种酶，要想从提取液中分离纯化出某一种酶，必须根据这种酶的特性选择适合的分离纯化方法。酶分离纯化的方法很多，卜•面简介几种常见的酶的纯化方法。2.1根据酶分子大小的差别的分离方法1、透析与超滤⑵透析法是利用半透膜将分子大小不同的酶彼此分开。在纯化的过程屮广泛地用来将酶液中的盐、有机溶剂或低分了量的抑制剂除去。超滤法是利用高压力或离心力，强使水和其他小的溶质分了通过半透膜，从而导致酶液的浓缩，这个步骤能减少纯化过程中式样的体积，在分离的过程中可选择不同孔径「31的泸膜截留不同分子量的酶。2、凝胶过滤法也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大

8、小分离酶最有效的方法之一。柱屮最常用的填充材料是葡萄糖凝胶葡萄糖凝胶（Sephadexgel）和琼脂糖凝胶（