ⅲ— 硷性磷酸酶的分离纯化及鉴定

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1、酶工程实验内容实验一 硷性磷酸酶的分离纯化一、实验目的1.掌握酶分离纯化的一般步骤及相关原理；2.悉碱性磷酸酶的分离纯化的方法步骤。二、实验原理本实验采用有机溶剂沉淀法从肝匀桨中分离纯化碱性磷酸酶(简称AKP)。先用低浓度醋酸钠(低渗破模作用)制备肝匀浆。醋酸镁则有保护和稳定AKP的作用。匀浆中加入正丁醇可使部分杂蛋白变性，释出膜中酶，过滤后，以去除杂蛋白。含有AKP的滤液用冷丙酮和冷乙酸进行重复分离纯化。根据AKP在33％的丙酮或30％的乙醇中溶解，而在50％的丙酮或60％的乙酸中不溶解的性质，用冷丙酮和冷乙醇

2、重复分离提取，可从含有AKP的滤液中获得较为纯净的碱性磷酸酶。三、仪器、原料与试剂仪器移液管、量筒、玻璃勺浆器(管)、剪刀、离心机、新华定性滤纸。原料新鲜兔肝试剂1.0.5mol/L醋酸镁溶液：107.25g醋酸镁溶于蒸馏水中，定容至1000m1。2.0.1mol/L醋酸钠溶液：8.2g醋酸钠溶于蒸馏水中，定容至1000m13.0.0lmol/L醋酸镁一0.01mol/L酸酸钠溶液：准确吸取20mL0.5mol/L醋酸镁溶液及100mL0.14mol/L醋酸钠溶液，混匀后定容至1000m1。4.Tris—HClp

3、H8.8缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷12.1g，用蒸馏水溶解后定容至1000mL，即为0.1mol/LTrls溶液。取100m10.1mol/LTrls溶液，加蒸馏水约780mL，再加0.1mol/L醋酸镁溶液100m1，混匀后用1％冰醋酸调pH为8.8，用蒸馏水定容至l000m1。5.正丁醇、丙酮、95％乙醇均为分析纯试剂。四、实验操作分离纯化硷性磷酸酶的操作流程如下（以下操作均在0-4℃进行） 将分离提取的硷性磷酸分装成2ml瓶，冰冻干燥保存或液体保存也可，但均置于-60℃低温冰箱保存。应用时稀释5—7倍测其

4、Km值。 实验二硷性磷酸酶的动力学鉴定——Km测定一、原理当温度、PH及酶浓度恒定的条件下，酶促反应的初速度随作用物浓度[S]增大而增大，但增大到一定限度时，作用物浓度再增加，则反应速度不再增加。此时反应速度为最大速度（Vmax）。MichaelisMenten对酶促反应速度与作用物浓度之间的这种关系进行了大量实验研究，并于1913年提出了数学方程式，即著名的米一曼方程式：式中Km即为米氏常数，Vmax为最大反应速度，当V=Vmax/2时，则Km=[S]。Km是酶的特征常数，测定Km是研究酶的一种方法。由于用Mi

5、chaeis-Menten方程中的V与[S]作图求Km，不方便，Lineweaver-Burk将上式变形，以4/V对1/[S]作图，即：作图后，将各点连线延长，直线与横轴的交点为   ，根据在横轴上的截距，可以计算出该酶的Km。本实验以硷性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其作用物，硷性磷酸酶能分解磷酸苯二钠产生酚和磷酸，酚在硷性溶液中与4氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成红色的醌衍生物，根据红色深浅可测出酶活力高低。其反应式如下：利用在不同作用物浓度的条件下，测定的酶活性（A），按Lieweaver-Burk二氏法作

6、图，从 x 轴上的截距求得其Km值。 二、实验准备 （一）仪器 1.恒温水浴2.滴定管3.有塞锥瓶4.721型分光光度计（二）试剂1.0.04mol/L作用物液：  称取10.16g磷酸苯二钠（C6H5PO4Na2·2H2O），用煮沸后冷却的蒸溜水溶解，并稀释至1,000ml，加4ml氯仿防腐，贮于棕色瓶内，置冰箱内保存，可用一周。2.0.1mol碳酸盐缓冲液（pH10.0）：称取无水碳酸钠6.36g及碳酸氢钠3.36g，溶解于蒸馏水中，并稀释至1,000ml.3.硷性磷酸酶液： 取纯化的硷性磷酸酶5mg，用pH

7、10缓冲液配制成100ml，放置冰箱内保存。或用自己提取的硷性磷酸酶液，用pH10缓冲液稀释至5—7倍。4.0.5mol/LNaOH溶液5.0.3%4氨基安替比林： 称取3g4氨基安替比林及碳酸氢钠42g，用蒸馏水溶解，并稀释至1,000ml，贮于棕色瓶中，放冰箱内保存。6.0.5%铁氰化钾： 称取10g铁氰化钾及30g硼酸各溶于800ml蒸馏水中，溶解后两液混合加水至2,000ml。置棕色瓶中，放冰箱内保存。三、操作1.取大试管7支，按下表操作：加入酶液，混匀之后立即计时，各管在37℃水浴中准确保温15分钟后，

8、立即加入0.5MolNaOH液1.0ml以终止反应。2.显色各管中加入0.3%4氨基安替比林1.0ml和0.5%铁氰化钾2.0ml，充分混匀，放置10分钟，以0管为对照，在波长510nm下比色，记录各管的吸光度。3.作图所策测各管的吸光度代表各管中反应速度V，以之为纵轴，以作用物浓度[S]为横轴，在坐标纸上连接各点作图，观察曲线的形状。以各管吸光度值的倒数为纵坐标，以作用