Red重组技术研究进展

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1、Red璽组技术研究进展*中国牛.物工程杂志ChinaBiotechnology,2006,26(1):81〜86张全籽高会杰佟明友(屮国石汕化工股份有限公司抚顺石汕化工研究院抚顺113001)摘耍主要从Red系统组成元件、作用机理、重组策略以及先进性和发展前景四个方面综述了利用Red重组系统敲除或替换细菌染色体目的基因的方法。首先简要介绍了传统的细菌染色休重组技术，指出了其屮的缺陷。然后提出了Red重纽技术的定义：利川噬菌体Red系统介导来实现外源线性DNA片断与细菌染色体的靶基因进行同源重纟fl的方法，外源线性DNA通常是PC

2、R产物、寡核昔酸片断等，在它们的两翼各含冇与染色体靶基因两翼同源的序列40~60bp。这种Red重组技术省去了体外DXA®切和连接等步骤，便细菌染色体靶基因的敲除与替换操作相对简单，逐渐成为棊因功能探索以及新菌株构建的冇力手段。关键词Red重组系统细菌靶基因基因敲除中图分类号Q813.4收稿口期：20050426修回日期：20050929*中国石油股份有限公司资助项冃(104003)**电了信箱：zhangquan@fripp.com.cn日益成熟的微生物分了克隆技术为目的基因的研究提供了冇效手段。例如hl的棊因的失活是hl前研

3、究基因的热点领域，最常用的方法是等位替换。在细菌中这种等位替换方法通常需要闭合环状的克隆载体介导才能实现［广3］。而在酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和白色念珠菌(Candidaalbicans)中外源线性DNA片段町直接与染色体中的靶基因进行同源重组［4、6］。大多数细菌因为核酸内切酣的存在而不能如S.cerevisiae等一样转化线性DXA［7］。敲除细菌基因的传统方法是利用RecA重组系统。RecA重组系统是大肠杆菌内源性的同源重组体系，它由RccA和RecBCD组成。RecA蛋白促进各类DNA分

4、子间的同源联会和配对。RecBCD分子量较大，是由RecB、RecC和RecD组成的复合体，具冇ATP依赖的外切酶V和解旋酶活性，它能与双链切口结合解开DNA链,并在Chi位点形成单链，然后由RecA蛋口促进同源重纽。这种方法需要较长的靶基因同源序列，还需构建具有靶位点的质粒。噬菌体Red重组系统可以催化同源侧翼序列短的线性DNA片断与细菌染色体的靶基因进行同源重组。这种利用噬菌体Red系统介导来实现外源线性DNA片断与细菌染色体靶基因进行同源重组的方法即为Red重组技术，外源线性DNA通常是PCR产物、寡核芹酸片断等，在它们的

5、两翼各含有与染色体靶基因两翼同源的序列40、60bp。这种Red重组技术省去了体外DNA酶切、连接等步骤，使细菌染色体靶基因的敲除与替换操作相对简单，逐渐成为基因功能探索以及新菌株构建的有力于•段［&9］。下文将论述Red重组系统的结构、作用机理及其在细菌染色体基因敲除中的应用。IRed重组系统的结构X噬菌体基因Red区段编码了一个能够启动细菌染色体与外源DNA发牛•同源重组的系统。Red重组技术就是利用整合到细菌染色体或质粒中的Red系统编码的Red重组酚来实现外源PCR片段与基因组中靶基因的同源重组。XRed区段包括3个基因

6、：bet(akaP)>exo和gam(akar)［&10~13］。Exo是5'—3’夕卜切酶,能降解线性DNA的5’末端。晶体学研究发现，Exo核酸外切酶三个亚基组成环形聚合体，具有一个漏斗型的屮心通道。bet基因编码的0蛋白是一个单链DNA(ssDNA)结合蛋白，它nJ以结合到由Exo产生的单链DNA的3’端，从而启动互补DNA链的退火,引发DNA链的交换反应［&1广13］。B蛋口在溶液中的游离状态为坏状物，当结合到dsDNA时形成螺旋状纤维［14］。B蛋口还可与Exo外切核酸酶形成复合体，调节核酸溶解和重组启动。garnet

7、因的表达产物Gam蛋白与宿主的RecBCD复合体结合并抑制宿主外切核酸酶活性，阻止外源线性DNA片段被降解［8］。1.1Wanner重组系统的结构2006,26(1)张全等：Red重组技术研究进展中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVol.26No.12006Datscnko等［10］构建的辅助质粒如pKD20与pKD46含有包括gam基因在内的整套Red系统，见图U利用pKD20-UpKD46质粒完成的重组又称Wanner重组。pKD20有优化的核糖体结合位点，在阿拉们糖启动子ParaB控制下高效表达Y、B和E

8、xo酶。pKD20还是一个温度敏感性复制子，易从宿主中消除［10］。PKD46与pKD20相似，是在阿拉伯启动子PBAD控制下表达Red系统Y、B和Exo酶的温度敏感型低拷贝质粒。两种质粒部有入噬菌体基因1894bp(31348-33241)和2154bp(31