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1、蛋白质化学蛋白质的层析分离根据物质在固定相和流动相中的分配系数的不同，使分配系数只有微小差异的物质获得最大的分离效果。根据两相状态，分为：气相层析和固相层析根据层析机理，分为：吸附层析、离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析层析法的一般原理溶质在两个互不相溶的溶剂中，它在固定相和流动相中的浓度比是一个常数，称为分配系数，这就是分配定律：或用溶质在两相中的体积表示：D=.vsvmkc1c2k=3216168168412124281282层析柱分离物质示意图塔板理论柱子的分离效率在一定条件下主要决定于塔板数的多少,柱子的塔板数
2、主要依赖于柱长和理论塔板高度:N=L/H=16(Ve/W)2H:理论塔板高度Ve:洗脱体积W:峰宽D值一定的条件下,提高柱效:(1)增加柱长(2)降低理论塔板:降低流速和支持物的颗粒度离子交换层析原理:根据蛋白质分子所带电荷的不同来达到分离的目的.经化学反应将解离集团引入到惰性支持物上,通过不同的电荷来分离分子。解离离子带负电，结合阳离子，称为阳离子交换柱。带正电，结合阴离子，称为阴离子交换柱。注:pH在等电点处,分子的净电荷为0,无相互作用;pH在等电点以上,分子带负电,可结合于阴离子交换剂;pH低于等电点,分子带正电
3、,可结合于阳离子交换剂.离子交换层析平衡:电荷量越大,结合越牢,在柱中移动速度越慢;电荷不同,亲和力不同.洗脱:带电蛋白质分子与交换剂的结合可逆.通常,用盐梯度和pH梯度可把吸附的蛋白质从柱上洗脱下来.离子交换剂的基本类型解离集团类型名称性质DEAE-O-CH2-CH2-N+-(C2H5)2弱碱性QAE-O-CH2-CH2-N+-(C2H5)3强碱性Q-CH2-N+-(CH3)3强碱性CM-O-CH2-COO-弱酸性SE-O-CH2CH2-SO3-强酸性SP-O-CH2CH2CH2-SO3-强酸性P-O-PO3-中酸性S
4、-O-PO3-强酸性离子交换的支持物纤维素具有松散的亲水性网络,较大的的表面积、吸附容量大，通透性好。葡聚糖凝胶(Sephadex)既有离子交换剂的性质，又有分子筛效应。琼脂糖凝胶(Sepharose)吸附容量大，能维持交好的流速和分辨率。Fastflow的Sepharose。层析条件的选择了解样品的性质：稳定性、不同pH下的带电情况、pH和盐浓度对活性或溶解度的影响。选择正确的离子交换剂。电荷、大小选择正确的缓冲液合适的pH值;不能干扰洗脱液的测定。用紫外吸收法测定蛋白质时，不能用带苯环的缓冲离子；在215~225nm
5、范围测定肽键含量时，不能用带羧基的缓冲液。阳离子交换用阴离子型缓冲液：磷酸、醋酸等；阴离子交换用阳离子型缓冲液：Tris-HCl等。柱层析技术柱床体积至少要比结合所有样品所需要的要大2~5倍。层析柱应用起始缓冲液充分平衡。样品应溶在与起始缓冲液具有相同的pH和离子强度。要求高分辨率时，上样量不能时紧密的区带超过床体积的5%。洗脱可以用改变盐浓度或者改变pH来完成。具体实现可分为梯度洗脱与阶段洗脱。掌握洗脱速度。太快可能降低分辨率；太慢，洗脱峰会扩散。离子交换剂的再生类型处理用的酸或碱浓度浸泡时间纤维素0.5mol/LHC
6、l或NaOH3~4h（含0.5mol/L的NaCl）Sephadex0.1mol/LHCl或NaOH0.5h（含1mol/L的NaCl）Sepharose1mol/LNaAc(pH3.0)或0.1mol/LNaOH可在柱中再生(含1mol/LNaCl)合成凝胶0.5~1mol/LHCl或NaOH长时间(含1mol/LNaCl)浸泡无影响层析一般步骤：处理介质↓装柱↓平衡↓上样↓洗涤↓洗脱↓介质再生离子交换层析过程图离子交换层析过程图习题三个氨基酸（Leu,Asp,Lys）的混合物，经过一个sulphonotedpolys
7、turene阳离子交换树脂粒，用pH5的缓冲液洗脱，洗脱液中氨基酸出现的顺序是A．Asp,Leu,Lys;B．Leu,Asp,Lys;C．Lys,Leu,Asp;D．Leu,Lys,Asp习题今有以下4种蛋白质的混合物：（1）pI=10；（2）pI=4；（3）pI=8.6；（4）pI=5.若不考虑其它因素，当它们流过DEAE-纤维素阴离子交换柱，用线性盐梯度洗脱时,这些蛋白质的洗脱顺序如何，并具体说明其原因。答案:在离子交换柱上，带更多负电的吸附能力更强。四种蛋白质PI值的顺序为1>3>4>2。因此，在某种pH值下，所带
8、电荷由正到负的顺序为1>3>4>2。因此，洗脱出现的先后顺序就是1>3>4>2。凝胶过滤层析原理:根据分子量的大小不同而达到分离的目的。载体是一种多孔的凝胶。分子直径比凝胶孔径大的分子,不能进入凝胶颗粒的微孔中。其他分子由大到小先后从凝胶中流出。凝胶层析支持物的性质。惰性凝胶介质，不与溶质发生反应。所带电荷低。凝胶颗
