蛋白质分子基础2-蛋白质制备

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1、蛋白质分子基础第二章:蛋白质的制备本章主要内容1.蛋白质分离纯化的一般程序2.蛋白质的粗分离材料的选择和细胞抽提液的制备蛋白质的浓缩和脱盐沉淀法分级蛋白质3.蛋白质的层析分离原理,离子交换、凝胶过滤、亲和层析等4.蛋白质的电泳分析原理、类型、聚丙烯酰胺电泳等本章主要内容5.蛋白质的结晶原理、条件、方法6.提纯过程中的定量双缩脲法、福林试剂法、紫外吸收法、考马斯亮蓝染色法7.蛋白质的纯度标准电泳法、免疫化学法等8.蛋白质的大规模分离纯化蛋白质来源及释放、分离和浓缩、大规模层析与电泳。第一节蛋白质分离纯化的一般程序1.生物组织

2、的机械破碎:研磨法、超声波法、冻融法和酶解法等(细胞外分泌物无需破碎)。2.根据蛋白质的特性，选择不同的溶剂进行抽提。水溶性蛋白用中性缓冲溶液抽提，酸性蛋白用稀碱性溶液抽提，脂溶性蛋白用表面活性剂抽提等。3.离心:去亚细胞颗粒、细胞碎片等4.粗提:离心除去固体杂质后，可通过沉淀法、超滤法、萃取法等处理，得到蛋白质粗制品。5.精制：可用层析法、电泳法等进行精制。6.结晶：取得蛋白质晶体并测定蛋白质的性质。除核酸生物体组织无细胞抽提液破碎、溶解、离心分析溶解分级法精制品各种层析方法或电泳法结晶冻干粉前处理粗分级细分级蛋白质分离

3、的注意事项要建立一个方便灵敏的分析方法。要选择一种最好的含有目的蛋白质的材料分离步骤要尽可能少尽量避免蛋白质在提纯中的变性。低温（40C）、蛋白质酶抑制剂巯基试剂（二硫苏糖醇）可防止半胱氨酸的氧化。金属螯合剂（EDTA等）可防止重金属离子对酶的失活作用。第二节蛋白质的粗分离材料的选择和细胞抽提液的制备蛋白质的浓缩和脱盐沉淀法分级蛋白质(一)材料的选择材料选择的原则目的蛋白质的含量要高容易获得不同种属和个体会有差别动物：性别、年龄、季节、生理条件不同，蛋白质在质和量上会有区别植物：不同组织、器官、不同发育阶段、有外来病理侵袭

4、时各不相同。注意:取材后立即使用或置-10−-50℃保存备用。二、细胞破碎方法及细胞提取液的制备破碎细胞的方法温和方法较剧烈方法剧烈的方法温和方法细胞溶解红细胞，渗透压破碎细胞膜酶降解溶菌酶处理细菌，消化细胞壁化学溶解/自溶甲苯抽提酵母，部分溶解细胞壁手动匀浆器肝组织，迫使细胞通过窄隙撕开细胞膜研磨肌肉等，研磨产生的切割力破坏细胞较剧烈方法韦林氏捣切器（waring型）大多数动物组织和植物组织切削作用和剪切力磨料研磨（砂、氧化铝）植物组织与细菌，微小粗糙表面破坏细胞壁剧烈方法压榨机（frenchpress）迫使细胞在高压下

5、通过小孔，剪切力破坏细胞细菌和植物细胞超声作用剪切力和空化作用破碎细胞细胞悬浮液震动玻璃球(直径0.5~1mm)与玻璃珠一起快速震动，撕开细胞壁细胞悬浮液研磨机迫使细胞在高压下通过小孔，剪切力破坏细胞，大规模操作。作用于悬浮液抽提缓冲液的提取尽量使用类似于生理条件下的缓冲液，常用的缓冲液有：20~50mmol/L的磷酸缓冲液，pH7.0~7.5；0.1mol/LTris-HCl，pH7.5；缓冲液中可加入EDTA（1~5mmol/L）或者蛋白质稳定剂等。其他注意事项动物组织和器官要尽可能除去结缔组织和脂肪。制备植物细胞时，

6、在缓冲液中加入聚乙烯吡咯啉酮(PVP)可以减少褐变,它可以吸附多酚化合物。革兰氏阳性菌可用溶菌酶消化，370C处理15分钟即可溶解细胞壁。革兰氏阴性菌较难消化。可先用非离子去污剂（如TritonX-100）、巯基乙醇或甘油处理细胞。在溶液中还可加入脱氧核糖核酸酶I（10ug/mL），可以使溶液的黏度降低，可以提高抽提液的质量。三、膜蛋白的释放膜蛋白存在于细胞膜或各种细胞器当中(叶绿体、线粒体、内质网、或细胞核）外周蛋白通过静电力或共价键和外膜脂质的极性头部螯合在一起。占膜蛋白的20~30%内在蛋白（固有蛋白）嵌合在膜脂双层

7、结构中。大部分膜蛋白是固有蛋白生物膜的功能生物膜研究的意义外周蛋白外周蛋白的分离改变离子强度金属螯合剂（EDTA）可将其抽提出来膜内在蛋白的提取提取的原则抽提膜蛋白时，首先削弱膜蛋白和膜脂的疏水结合，同时保持疏水基暴露在外的天然状态。此过程叫做增溶作用。常用的增溶剂是去污剂，它可以使膜蛋白疏水部分与膜分离，同时保留住膜蛋白表面的疏水结构。用去污剂增溶之后，膜蛋白要用透析的方法除掉去污剂，再进行其他方法的分离纯化。膜内在蛋白的提取常用的去污剂按结构可分为四种：1.阴离子去污剂：脱氧胆酸盐2.阳离子去污剂溴化十二烷基三甲铵3.

8、两性离子去污剂二甲基十二烷基甘氨酸4.非离子去污剂TritonX-100膜蛋白分离纯化胰岛素受体从大鼠肝脏中分离胰岛素受体释放膜蛋白的其他方法用脂肪酶A消化脂肪，使膜蛋白释放出来。在高pH值和较高温度下进行超声作用，以释放膜蛋白。在低温(-200C)下，用丙酮处理组织和细菌，抽提出大部分脂肪。再将所得到