资源描述：
《生物技术概论实验指导》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、青海大学生态环境工程学院《生物技术概论》实验指导授课班级：环境科学2012教师：丁栋生物工程教研室制2014年10月19日青棵(HordeumvulgareL.var.nudumHook,f.),因其种子成熟后口」从颖壳中脱落，所以又称裸大麦(nakedbarley),是一种禾木科作物，主要分布于青藏高原地区。由于海拔高，其生长环境的温度和对较低。在青棵生长期间，经常出现霜冻以及雪、雹等天气，夜间温度往往低于o°c时青棵仍生长良好。因此，青棵具有较强的抗低温胁迫的特性，是一个潜在的抗寒基因资源库。开发这些抗寒相关基因，研究其调控
2、机制将具有十分重要的理论和实践意义。/7/r5(low-temperature-responsivebarleygenes)是一类存在于大麦(HordeumvulgareL.)中的低温反应基因。口前，E1经报道的有b"4(blt4・2、bU4・6、blt4・9)、bltl4©ltl4・l、bltl4・2)、blt63、bltl01@ltl01・2)、勿必/0和bltSOl等，它们主要受低温诱导，其中个别基因(如b"4等)也同时受干旱和ABA胁迫。在这些基因中"⑷和blt801的基因功能研究比较清楚。blt4基因编码一种脂肪迁移蛋
3、白，可以通过改变质膜的组成来提高膜的冷稳定性，勿怡0/基因则可能编码一种RNA结合蛋口。而其他bits基因编码蛋白的功能诡未见报道。木实验以hbltl4.2基因(PCR产物大小487bp)为实验对象，通过DNA提取、PCR实验、载体连接及转化、菌落PCR等实验内容，为同学们了解掌握基因工程基本实验操作方法打下基础。实验一CTAB法提取植物组织DNA实验目的：掌握CTAB法提取植物组织DNA的基本实验内容；了解不同试剂的配制方法及在DNA提取中的作用。实验材料：青棵实验试剂：CTAB、酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、NaAc、液氮、疏
4、基乙醇、Tirs碱、浓盐酸、EDTA-Na2-2H2O>NaOH、NaCl、琼脂糖凝胶实验仪器:研钵、恒温水浴、离心机、离心管、电泳仪、电泳检测仪实验方法：1•试剂配制1)2xCTAB提取液(PH8.0)：2%CTAB,1.4MNacl,0.02MEDTA,0.1MTris-cl,0.2%筑基乙醇。即称取CTAB2g加蒸憾水40ml,加IMTris-cl(PH8.0)10ml,0.5MEDTA(PH8.0)4ml和5MNaCl28ml,待CTAB溶解后用蒸憾水定容到lOOmlo2)IMTris-cl(PH8.0)100ml:12
5、.1lgTrisWc；ddH2O,80ml；HC1,4.9ml三者混匀充分溶解后，滴加浓盐酸调PH至&0,定容至lOOmL3)0.5MEDTA(PH8.0)100ml:在80ml水中加入18.01gEDTA•Na2•2H2O搅拌溶解，用NaOH调PH至8.0(约2gNaOH颗粒)，ddHzO定容至100mlo4)5MNaCl100ml：称取29.22gNaCl,用ddH?。定容到100mlo1)3MNaAC10ml：称取2.46gNaAC,用ddl^O定容到10mL2.操作步骤1)称取l.Og幼嫩的叶片，在研钵中加入液氮预冷，将
6、叶片放到液氮中研磨均匀，直至全部研磨至粉末，转入1.5ml离心管中，加入600ul65°C预热的CTAB溶液(用前加入终浓度2%的铳基乙醇)2)将装有CTAB和样品的EP管放入65°C水浴，约lh3)冷却后，加入600ul的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1=300:28&12),混匀，12000rpm,离心15min4)吸上清，装入一新的EP管5)加入600ul氯仿：异戊醇(24:1=576:24),12000rpmo离心15min6)吸上清，转入一新的离心管中，加入1/3体积的NaAc(3mol/l)7)加入lml-20°C预
7、冷的无水乙醇，混匀后置于-20°C(-80°C,30min)3-4h8)12000rpm,lOmin弃上清9)向离心管中加入75%的乙醇洗涤2・3次，置于吸水纸上倒置晾干10)加入ddH2O(10・20ul)溶解样品11)1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA条带(20-100kb)作业：1.CTAB在DNA提取屮有什么作用?2•附图验证你的实验结果？3.NaAC的作用是什么？实验二PCR实验实验目的：掌握PCR的基本原理及实验步骤。实验材料：实验一提取DNA实验试剂：2XTaqMasterMix试剂盒、琼脂糖凝胶实验仪器：恒温水浴、离心
8、机、离心管、PCR仪、电泳仪、电泳检测仪实验方法：1•试剂配制组成成份体积Template<1pgPrimer1(10pM)1plPrimer2(10pM)1pl2xTaqPCF?MasterMix12.5plddH2O补至25nl2.PCR实验1）将装溶剂的P
