小鼠胰岛分离纯化及体外功能检测实验探究

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1、小鼠胰岛分离纯化及体外功能检测实验探作者：宋科瑛王瑞涛卢列盛董维平李克【摘要】目的：探讨获得高质量小鼠胰岛的分离纯化方法，评价其功能。方法：采用胆总管内胶原酶灌注膨胀消化胰腺的方法分离小鼠胰岛，不连续密度梯度离心法纯化胰岛，用双硫腺(Dithizone,DTZ)对胰岛进行特异性染色计算胰岛产量及纯度，以葡萄糖和茶碱刺激胰岛素释放检测胰岛功能。结果：胰岛的产量和活性主要与胰腺均匀膨胀和胶原酶的消化时间有关。平均每个小鼠胰腺能得到150〜250个高质量胰岛，活性>；95%,纯度>；90%o葡萄糖及茶碱(carbachol,Cch)刺激后胰岛素释

2、放量明显增加。结论:改良的胆总管内胶原酶灌注膨胀消化小鼠胰腺及不连续密度梯度Ficoll-400纯化胰岛的方法，可获得产量较高、纯度及功能较好的胰岛。【关键词】胰岛•分离・纯化・小鼠Isolation,PurificationandFunctionalAssessmentofIsletsinMice[ABSTRACT]Objective：Thetechnicaldifficultyinmouseisletsisolationandpurificationrestrictsitswideuseindiabetesandislettransplanta

3、tionfield・Herewereportedanddiscussedamodifiedmethodwithwhichtoisolateandpurifyhighqualityisletsinmice・Methods:Intraductalcollagenase-Pperfusionanduniformdistentionoftheglandwereappliedtodigestmicepancreas・AFicollgradientsolution(25%,23%,20%,and11%)wasappliedtomakethepurifica.t

4、iori.IsletswerethentestedfortheirspecificitybyDithiozine(DTZ)staining・Theisletfunctionwasassessedbytheglucose-andcarbachol-stimulatedinsulinsecretiontest・Results：Theyieldandviabilityoftheisletswerecloselyassociatedwithgoodglanddistentionandcollagenasedigestiontiming.Weusedthem

5、ethoddiscussedhere,eachmousepancreascouldyield150^250islets,withviability>；95%andpurity>；90%.TheinsulinreleasefromtheinvitroisletsfedwithhighconcentrationglucoseandCarbacholstimuliraisedtoasignificantlyhigherleveLConclusion：Theabove-mentionedmethodofmiceisolationandpurific

6、ationmightyieldhighqualityisletsforfurtherscientificuse・【KEYWORDS】Islets•Isolation•Purification•Mice胰岛移植被认为是有望治愈胰岛素依赖性糖尿病(insulin-dependentdiabetesmellitus)的新型治疗方法。小鼠品系纯正，可重复性好，可进行基因调控，自身繁殖力强，可缩短科研周期，已在国外胰岛移植和糖尿病研究领域，尤其是基因治疗领域，得到越来越广泛的应用[1-5]o但由于小鼠体积小，胰腺相关解剖结构细微，胰岛的分离纯化操作有一定的难

7、度。本研究参考学术交流中获得的纽约西奈山医学院和美国康奈尔大学医学院的小鼠胰岛分离纯化方案，结合国内实验条件，对小鼠胰岛的分离、纯化、培养作了改进。体外功能检测证实，该方法分离纯化的小鼠胰岛可用于胰岛移植的相关后续研究。1材料与方法1.1材料8〜12周龄的雄性C57BL/6小鼠，购自中国科学院上海实验动物中心，在清洁环境下喂养。NagashimaNo.5304型手术显微镜由日本永岛医疗器械株式会社制造。胶原酶-P为Roche公司产品，Ficoll-400为Pharmacia公司产品，超灵敏胰岛素ELISA试剂盒购自CrystalChemical公司

8、，DNA酶I购自Sigma公司，RPMI1640培养基、小牛血清和胎牛血清由GIBC0公司提供。1.2方法1.2.1分离液